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植物体细胞杂交研究进展 有性杂交是一种传统的繁殖手段，通过男女生子的结合转移和重组亲属遗产。这一育种技术在植物育种工作中发挥了巨大的作用。但是远缘杂交的有性不亲和、双亲花期不遇、雌/雄不育等阻碍了这一技术在植物育种中的应用。植物体细胞杂交(somatic hybridization)是以原生质体培养为基础,人工诱导使不同亲本原生质体融合,并通过对异核体的培养产生体细胞杂种的技术。它可以克服有性杂交遇到的前述障碍。体细胞杂交在转移抗逆性状,进行作物改良,实现远缘重组,创造新型物种,以及定向转移胞质基因控制的性状和利用配子-体细胞杂交产生三倍体植物上显示出重要的应用前景,并对丰富种质、保持和促进生物多样性具有重大的意义。利用体细胞杂交转移的基因为亲本自身所携带,不存在安全性问题。随着分子生物学的发展,在获得上述体细胞杂种的同时,体细胞杂交的技术、方法、检测手段等都得到了一定提高。 1 支付体细胞杂交技术的应用 20世纪70年代至80年代,随着原生质体培养技术的不断改进,通过原生质体培养能再生植株的植物种类迅速增加。其中茄科(Solanaceae)的烟草属(Nicotiana)、番茄属(Lycopersicum)、十字花科(Cruciferae)的芸苔属(Brassica)、伞形科(Umbelliferae)的胡萝卜属(Daucus)等双子叶植物,由于其原生质体培养较容易而被广泛应用于体细胞杂交研究。但在此期间,涉及目标性状转移的研究很少。随着不对称细胞杂交技术的建立和发展,利用植物体细胞杂交技术转移目标性状以改良作物的研究成为研究的热点。体细胞杂交技术虽然有其随机性的缺陷,但可通过对称或不对称融合技术转移细胞核中的染色体组、染色体片段,或者细胞质中的叶绿体DNA和线粒体DNA,因而可利用的基因资源十分广泛。 1999年Li等不完全统计,已用于育种目的的体细胞杂种植株从12科、22属、33个作物品种中再生,其中65%为种间的体细胞杂种。在这些融合组合中,供体所具有的目标性状包括抗冻、抗干旱、抗病毒、耐真菌、抗虫、CMS等,其中融合的作物90%以上为双子叶植物。同时国内外还开展了空间电融合技术的研究。20世纪80年代中期,单子叶植物原生质体再生植株相继被突破,开始对单子叶作物应用体细胞杂交进行改良,如玉米与小麦间再生植株。2000年后,体细胞杂交无论在双子叶还是单子叶植物中都有了长足的发展,主要集中在禾本科、芸香科、菊科、豆科、茄科、十字花科和伞形科、百合科8个科、29属、36个植物种中再生。除了上述目标性状,还增加了耐盐、吸收重金属、药用成分、抗虫、高品质等性状,而且这些体细胞杂交中85%为属间体细胞杂交。尤其是单子叶禾本科:小麦与其多种近缘属间植物进行体细胞杂交,不仅获得再生植株,而且这些新品系和株系存在一些优良的农艺性状,如高品质,耐盐和抗虫等,此外还对小麦与高冰草属间杂交F2代及小麦和Thinopyrum ponticum的F3~F6代进行了研究,这些优良性状能够稳定遗传;高羊毛的CMS通过体细胞杂交转移到多花黑麦草;芸香科不同属间也获得了多种体细胞杂种。 2 体融合方法 诱导异源原生质体融合产生异核体(heterokaryon)即杂种细胞,是体细胞杂交程序的第一个关键环节。目前主要有以下两种方法。 2.1 peg法聚光法 自20世纪70年代中期,Kao等建立起聚乙二醇(PEG)——高pH高钙法以来,直到20世纪90年代,所获得的体细胞杂种大部分是用该化学诱导法诱导融合产生的,后来又发展了电融合法和聚集微素激光法。但一直以来PEG法都被广泛使用,聚集微素激光法应用极少。1999年,夏光敏等用PEG法诱导普通小麦与紫外线照射的高冰草原生质体融合,产生了具有优良性状的F2代穗系。2001年Yue等用PEG法将獐毛麦的耐盐性转移到普通小麦。2005年Wang等采用PEG法将用IOA和紫外线分别处理的Arabidopsis thaliana(L.)和Bupleurum scorzonerifoliumWilld.融合,形成科间不对称杂种并再生植株,染色体数目检测发现:紫外线照射的供体(B.scorzonerifoliumWilld.)的染色体完整存在,但是受体染色体却被排斥,只有少数片段渗透到杂种细胞中。 2.2 细胞杂交成功的患者 用细胞融合仪产生交变电压和高压脉冲电场诱导植物细胞融合,是目前研究最热的物理诱导融合法。1979年Senda首次报道了植物原生质体可以在电脉冲作用下进行融合。Zimmemenn等又进一步发展了动植物细胞电融合的方法和仪器。由于电融合较之化学融合有操作简便、易于控制、副作用小、融合率高、应用范围广等特点。从20世纪80年代中期起,国外对动植物细胞电融合的方法和条件进行了大量研究,细胞杂交成功的例子相继被报