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生物被膜鉴定方法的研究进展 在自然环境中，细菌通常以游泳和固体的形式存在。传统上,所有生态系统中的微生物有组织地生长的聚集体叫细菌生物被膜(bacterial biofilm)。现在认为,细菌生物被膜是指细菌附着于惰性或者活性实体的表面,繁殖、分化并分泌一些多糖基质,将菌体群落包裹其中而形成的细菌聚集体膜状物。任何细菌在一定条件下都可以形成生物被膜,生物被膜是微生物的王国,单个生物被膜可由同种或不同种微生物形成。一直以来,对于细菌生物被膜的研究重点是细菌如何黏附到物体表面,如何形成生物被膜,形成生物被膜后细菌的分散方式等,而对于其鉴定方法却尚未做全面阐述,故笔者拟对几种常见的生物被膜鉴定方法作一简单综述,为细菌生物被膜的进一步研究提供参考。 1 生物被膜的观察 细菌首先形成微小菌落,然后逐渐被分泌的黏多糖包绕形成生物被膜,肉眼不易直接观察,需通过染色、放大等处理后才能对生物被膜进行观察。从目前的研究情况来看,常见的生物被膜鉴定方法主要有以下几种。 1.1 生物被膜的制备方法 试管法(glass tube method)是一种简单、快捷、所需试剂和仪器等试验条件较低的一种生物被膜鉴 定方法,被广泛运用于生物被膜的初步定性检测。 主要试剂和仪器:培养基、玻璃试管、37℃恒温振荡器、烘箱、超净工作台和结晶紫染料等。 主要操作步骤:①挑取待检单克隆菌株接种于培养液里37℃振荡培养过夜;②转接20μL过夜培养物加入装有2mL培养液的硼硅酸盐玻璃试管中;③在37℃恒温振荡器上以150r/min培养12~16h;④用注射器将试管中的培养液吸取后,加入2.5mL的10g/L Hucker结晶紫,室温孵育5min;⑤吸取试管中多余的结晶紫染色液后,在自来水下冲洗试管3~5min;⑥把试管倒置在滤纸上除去过多的水,并在37℃烘箱中烘干,观察、记录。设置空白对照。 2009年,达来宝力格等用试管法对胸膜肺炎放线杆菌(APP) 的15个血清型国际参考菌株和22个中国地方分离菌株在体外形成生物被膜的能力进行了定性分析,结合微量板定量检测法检测结果,得出大多数血清型的胸膜肺炎放线杆菌能在体外形成生物被膜,尤其在地方分离株中更普遍;与低毒力血清型的菌株相比,高毒力和中等毒力血清型的菌株更倾向于形成生物被膜的结论。2009年,Li等运用试管法鉴定了从污水处理系统和土壤中分离的18个菌株的生物被膜形成能力,同时评价了胞外多糖、鞭毛、N酰基丝氨酸内酯信号分子、胞外蛋白和蜂拥运动等五个因素对细菌生物被膜形成能力的影响情况。 由于受肉眼观察和结果判定存在主观差异的局限性,试管鉴定法对生物被膜微观形态的观察并不理想。此方法只能初步鉴定细菌是否具有生物被膜形成能力,不适合用于生物被膜的深层研究。但是如果需要大批量地检测细菌是否具有生物被膜形成能力,试管法是一个不错的选择。 1.2 硝酸银溶液法 银染法(silver staining method)是通过对生物被膜进行银染后,用普通光学显微镜对着色后的生物被膜进行观察的鉴定方法。它比采用电镜和激光共聚焦显微镜鉴定法的试验费用相对便宜,仪器要求也相对较低。 主要试剂和仪器:硝酸银、氯化钙、对苯二酚、硫代硫酸钠、250mL/L戊二醛、显微照相系统和普通光学显微镜等。 主要操作步骤:①将制作好的待测生物被膜经灭菌生理盐水多次充分漂洗,去掉浮游菌;②250mL/L戊二醛PBS溶液中固定1h;③蒸馏水清洗1min;④饱和氯化钙溶液结合15min;⑤蒸馏水清洗15min;⑥50g/L硝酸银溶液反应15min;⑦10mL/L对苯二酚溶液显色2min;⑧蒸馏水漂洗1min;⑨50g/L硫代硫酸钠溶液固定2min;⑩蒸馏水漂洗1min。银染后用普通光学显微镜观察。 注意事项:①试剂配制后不宜放置时间过长,否则硝酸银沉淀影响观察结果;②硝酸银溶液配制后需过滤,以免影响染色效果;③漂洗力度适中,既不能破坏生物被膜,又要漂洗干净;④染色后需及时观察,设置空白对照。 2007年,孔晋亮等分别用银染法和扫描电镜(scanning electron microscope,SEM)法对铜绿假单胞菌生物被膜进行了研究,银染后用普通光学显微镜和扫描电镜对生物被膜变化的观察结果完全相符,并且认为用银染法观察细菌生物被膜的变化操作便捷、结果可靠。2009年,佟金平等分别用银染法和扫描电镜法观察葡萄球菌的生物被膜,探讨了银染法观察生物被膜的可靠性,得出银染后普通光学显微镜和扫描电镜观察生物被膜结果完全相符的结论。 临床上治疗细菌生物被膜相关感染时,常需反复观察药物对细菌生物被膜的清除情况。目前细菌生物被膜变化情况的鉴定方法有扫描电镜、透射电镜(transmission electron microscope,TEM)和激光共聚焦扫描显微镜等方法,但是在一般级别