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人工促熟菲律宾蛤仔生物学特性的研究 生物学是繁殖生物学领域的一个重要指标。这项研究不仅可以深入了解生物的繁殖特性，而且可以进一步了解生物繁殖行为与温度和湿度之间的关系，并进行人工预测生物产卵。目前国内外对双壳贝类性腺发育的生物学零度已报道的种类有牡蛎(Ostrea virginica)、鲍(Haliotis discus hannai)、贻贝(Mytilus edulis)、海湾扇贝(Argopecten irradians)、西施舌(Coelomactra antiquate)等,所采用的研究方法也比较多[5~8],但在人工促熟条件下通过组织学手段确定生物学零度的方法国内外未见报道。本实验根据组织学观察,利用积温公式,拟合线性升温曲线,用数理统计对菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)人工促熟产卵实验进行生物学零度的计算,并通过组织学方法进行验证,以期为菲律宾蛤仔人工繁育产卵期的准确预报提供科学依据。 1 材料和方法 1.1 自然水温、壳长和平均壳长 实验所用菲律宾蛤仔均为2龄个体,从福建莆田取回样本共1 118个,每500 g为65个,平均壳长×壳高为(3.06 cm±0.19 cm)×(2.19 cm±0.12 cm),取样时海区自然水温10℃;由大连渤海湾取回样本共1 986个,每500 g为82个,平均壳长×壳高为(2.84 cm±0.23cm)×(2.07 cm±0.11 cm),取样时海区自然水温1℃。培育用水为沙滤自然海水,促熟密度为155个/m3。 1.2 方法 1.2.1 温度对日平均水温增加量的影响 将自然海区性腺尚未开始发育的菲律宾蛤仔取回在室内开始控温促熟直至自然排放精、卵,记录室内人工促熟过程中的日平均水温,根据积温公式K=H(T-t)通过两次实验拟合线性升温曲线L1,L2,其中K表示积温,H表示产卵时间,T表示生境水温,t表示生物学零度,h1,h2为达到生物学零度时的促熟时间,利用积温K值相同即S1=S2(图1、图2),计算得出生物学零度。两次实验人工促熟过程中实施相同的投饵、清污等管理措施。 1.2.2 精、卵的解剖 在人工促熟过程中的前25 d每隔5 d取样一次,之后每隔3 d取样一次直至自然排放精、卵为止。每次取雌雄蛤仔各5个,解剖取其性腺,Bouin’s液固定。常规石蜡切片,切片厚5μm,H·E染色,olympus光学显微镜观察和照相,利用组织学方法判断性腺开始发育的起始温度——生物学零度。 2 结果 2.1 日平均水温 于2004年、2005年促熟的两批亲贝从促熟到产卵分别历时45和35 d,水温变化见图3。 根据日平均水温拟合两个实验的升温曲线分别为L1和L2(图3)。 L1:Y=0.425 5X+4.098 2,R2=0.956 2(1)L2:Y=0.486 7X+6.436 1,R2=0.959 1(2)根据积温公式,由数理统计计算得出大连菲律宾蛤仔性腺发育的生物学零度为6.774℃。 2.2 平均水温测定 于2004年和2005年促熟的两批亲贝从促熟到产卵分别历时45和39 d,水温变化见图4。 根据每日的平均水温拟合两个实验的升温曲线分别为L3和L4(图4)。 L3:Y=0.425 5X+4.098 2,R2=0.956 2(3)L4:Y=0.397 4X+7.072 6,R2=0.943 6(4)根据积温公式,由数理统计计算得出福建菲律宾蛤仔性腺发育的生物学零度为10.990℃。 2.3 滤泡腔的精原细胞分离 根据组织学观察,大连菲律宾蛤仔从自然水温1℃的海区取回时滤泡内生殖细胞已排尽,呈一大空腔,滤泡壁仅为一单层扁平细胞组成。雌性个体滤泡上皮可观察到卵原细胞。滤泡因排空而呈萎缩退化,滤泡壁呈破损状(图5-1);雄性个体滤泡上零星分布少量的精原细胞,个别滤泡能见到少量残存的精子(图5-3),性腺仍没有开始发育,处于休止期。当升温促熟至7.0℃时发现有多于1/2个体滤泡腔仍为空腔,大小不一。滤泡壁开始增厚,壁上的生殖细胞处在活跃分裂期,不断从滤泡壁分裂增殖,雌性个体滤泡壁上出现一不连续的单层卵原细胞,并在卵原细胞之间逐渐出现一些少数卵黄形成前期的初级卵母细胞(图5-2);雄性个体滤泡壁上开始出现精原细胞和少数初级精母细胞。精原细胞呈圆形或三角形,紧贴滤泡壁,不断向滤泡腔分化形成精母细胞。至本期末,滤泡壁已由2~3层细胞组成(图5-4),性腺发育进入增殖期,可认为大连地区菲律宾蛤仔性腺发育的生物学零度在7.0℃附近,与计算结果6.774℃基本吻合。 2.4 精原子的退化 根据组织学观察,福建菲律宾蛤仔从自然水温10℃的海区取回时雌性个体滤泡腔中有部分处于退化状态的初级卵母细胞被分解吸收,滤泡壁上可见卵原细胞。部分滤泡腔出现中空,生殖细胞退化自溶,滤泡腔逐渐