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代谢组学的研究进展 1 代谢学与代谢组学 代谢组学创立于不到10年，但发展迅速（图1）。作为系统生物学的重要组成部分，它在诊断和功能因素研究中发挥着越来越重要的作用。随着基因组学研究的深入,功能基因组开始研究基因组、转录组以及蛋白组的数据与表型之间的关系;而细胞内的全部代谢物最接近于表型,从而产生了研究全部代谢物的要求,代谢组(metabolome)的概念由此诞生。Fiehn等在2000年以拟南芥叶为模型的工作标志着代谢组学成为功能基因组研究的一个重要组成部分。 目前,代谢组学的研究可分为以下3个层次:(1)目标代谢物分析(metabolite target analysis)。利用特定方法研究难分析化合物(difficult analytes),如植物激素等;(2)代谢谱分析(metabolite profiling)。对一系列预先设定的目标代谢物(如某特定代谢途径中所有代谢物,或者一组由多条代谢途径共享的代谢物)进行定量研究;(3)代谢组学。定性和定量特定条件下生物样品内的全部代谢物。然而,由于代谢物组成复杂、含量不一,样品制备过程的偏差,以及检测设备的量程及通量等问题,目前还难以分析全部的代谢物。因此,在现阶段代谢组学更多地被视为“非目标性”代谢物研究。与代谢组学相关的概念还有代谢指纹分析(metabolic fingerprinting),即对粗提代谢物进行高通量的定性分析,通过谱型比较将样品进行快速分类,或者寻找差异峰从而揭示生物对疾病或有毒物应答的生物标记物。另一个重要的概念是代谢产物组学 (metabonomics),多指以核磁共振(NMR)手段研究与疾病相关的代谢物。Nicholson等认为代谢产物组学是综合地研究某一时间点对细胞内全部代谢物的影响。不过,上述有关代谢组学的各种概念仍在发展和完善中。代谢组学会(Metabolomics Society)也将代谢组学的定义视为学会亟待解决的重要问题。 代谢组学与其它组学的研究对象的最大区别是其研究代谢组的变化。代谢组的变化是生物对遗传变异、疾病以及环境影响的最终应答。代谢组学受进化的影响较小,在不同物种间其检测方法比其它组学方法更为通用。以果糖二磷酸化酶检测为例,基因组或蛋白组研究需要掌握不同物种内该酶的编码基因或蛋白序列,并根据该信息设计相应芯片或质谱检测技术;代谢组则不管在何种生物内,该酶的底物和产物(1,6-二磷酸果糖和6-磷酸果糖)都是一致的,因而其检测方法可适用于所有物种。 与其它“组学”研究类似,代谢组学的突破在于将传统的代谢途径扩展为代谢网络的研究。通过“非目标性”地识别全部代谢物,定量它们在生物体系内的动力学变化,从而揭示传统方法无法观测到的代谢网络中不同途径之间的关系。因而,代谢组学成为系统生物学研究的重要组成部分。 2 反相lc技术的应用 由于代谢物的多样性,许多分析技术得到广泛应用。图2所示为各种代谢组学研究中常用的技术平台。根据样品的属性和研究目的来选择并综合利用多种技术平台。例如研究植物与微生物常使用质谱检测代谢物,而在动物样品的研究中则更多地采用了核磁共振(NMR)技术。目前,应用最广泛、最有效的技术是气相色谱-质谱(GC-MS)和液相色谱-质谱(LC-MS)。这两种技术可以检测包括糖、糖醇、有机酸、氨基酸、脂肪酸以及大量次级代谢物在内的数百种化合物。GC-MS具有较高的分辨率和灵敏度。因此,与GC-MS相关技术的发展很快,如采用GC-GC-MS技术增加单次分析可分离代谢物的种类;利用GC与飞行时间质谱(TOF-MS)联用可以进行高通量分析:由于TOF检测时间短,一个月可分析1000个以上样品;而且,利用升级的解析方法可以从植物叶片提取物的GC-TOF图谱中一次解析出1000种以上化合物。但是GC分离样品分子量范围有限,不能分离大分子及难挥发物质,同时热不稳定性物质在GC条件下容易分解。尽管衍生化过程会降低样品的通量,将样品衍生化后再进行GC分离,仍然是解决上述问题的一条有效途径。 LC-MS具有强大的分离能力,广泛应用于难挥发性物质的分析。目前,反相LC技术应用较普遍,但常规LC在分离极性较强物质时仍然具有重要作用。Tolstikov等开发出一种亲水作用色谱技术(hydrophilic interaction chromatography ,HILIC),采用(monolithic C18silica)长柱提高了分离效率,并且更易于与MS对接,检测到许多极性物质。此外,HPLC-MS、毛细管HPLC-MS、UPLC-MS以及多维色谱等技术逐渐应用到代谢物组学研究,明显提高了分辨率、灵敏度和通量。毛细管电泳在代谢物分离方面是一个新的发展方向,其效率优于LC和GC。 检测器是代谢物组分析关键因素之一。傅里叶变换离子回旋加速器质谱(FT-