牛磺酸喂养对单眼剥夺大鼠视觉中枢神经型一氧化氮合酶阳性神经元表达的影响.docxVIP

牛磺酸喂养对单眼剥夺大鼠视觉中枢神经型一氧化氮合酶阳性神经元表达的影响 虚弱是视觉发育敏感期的一种不可避免的障碍。目前临床多采用心理物理方法治疗弱视,辅助药物治疗少且效果不确定,深入开展对弱视治疗药物的研究有广泛的临床需求。牛磺酸是中枢神经系统最丰富的游离氨基酸之一,目前被公认为是神经介质、神经营养因子和神经保护性因子,已有研究显示牛磺酸是人类和许多哺乳动物的必需营养物质,缺乏可导致严重的视功能障碍及发育异常,而补充牛磺酸可促进脑发育并对多种原因引起的视觉损害起保护作用。本研究拟通过观察牛磺酸营养干预对子鼠在视觉发育关键期单眼剥夺后视中枢nNOS表达活性的影响,从而探讨弱视的分子神经生物学机制,探讨牛磺酸药物治疗弱视的可能性及其机制。 1 材料和方法 1.1 河北省医学学院动物实验室 新生健康雄性SD大鼠36只,体重6～8 g,由河北省医学科学院动物实验室提供。随机分成3组,正常对照组(N)12只,单眼剥夺组(MD)12只,单眼剥夺牛磺酸喂养组(MD+Tau)12只。 1.2 大鼠脑层开孔相关神经元的检测 1.2.1单侧眼睑缝合动物模型手术制作和饲养:大鼠至14日龄,在乙醚吸入麻醉下行左眼眼睑缝合术,术毕放回母鼠笼,眼睑裂开者不纳入实验。3组均笼养在同一饲养室的自然光线环境中,乳鼠生后22天断奶,正常和单眼剥夺组母鼠及断乳后子鼠用人工合成普通饲料喂养,牛磺酸组则用牛磺酸饲料喂养(在普通饲料基础上加入0.6%牛磺酸)。 1.2.2实验动物养至28日龄处死并灌注固定,参照Paxion鼠脑立体定位图谱,修取视交叉至乳头体段脑块,在左侧大脑皮层下方及脑干下方用锋利的剃须刀片切矢状线做标记,以区分左右两侧。连续冠状冰冻切片贯穿整个视皮层V1区与外膝体,厚度40 μm。切片经0.01 mol PBS充分漂洗后,使用抗nNOS多克隆抗体进行免疫细胞化学染色。每个皮层标本每隔3张切片取一张行Nissl染色。 1.2.3光镜下观察并计算机图像分析:参照Paxion鼠脑立体定位图谱进行视皮层和外膝体定位和分区,各组视皮层阳性标本均与自身邻近切片的Nissl染色结果对照进行层的定位。将每组内每只大鼠右侧V1区视皮层及背外侧膝状体取在最大核团处连续切片各5～6张,在Olympus光学显微镜及IPP图像采集系统的10×10倍光视野下,测量nNOS阳性神经元在右侧视皮层V1区单眼反应区各层及外侧膝状体背核的数目。数密度用免疫阳性细胞数 /切片核团面积表示。用Td2000真彩色病理、细胞图像分析系统,10×40倍光视野下,通过Camera Lucida精确绘出每组V1区不同类型nNOS阳性神经元200个,测定其胞体截面积及树突总长度。 1.3 xs的表示 所有数值均以均数±标准差(xˉ±s)(xˉ±s)表示。应用SPSS 12.0版统计软件包进行单因素方差分析检验,P0.05具有统计学意义。 2 结果 2.1 双极体神经系统中nas的表达 2.1.1在视皮质V1区,nNOS阳性神经元散在分布于Ⅱ～Ⅵ 层,以Ⅱ/Ⅲ层、Ⅴ和Ⅵ层为多,形态多样,胞体较大,突起明显,多数是双极和多极非锥体神经细胞,以成熟型为主。另外在V1区各层还有少量 nNOS阳性神经纤维分布,纤维较细。 2.1.2在外膝体,nNOS阳性神经元集中分布于外侧部,在背核呈散在分布,均为圆形或梭形的单、双极细胞,神经突分支很少。视皮层和外膝体阳性细胞形态学均表现为中间神经元。 2.2 图像的计算机分析 2.2.1 显著性分布p,q (MD+Tau)组、N组分别与MD组比较,在Ⅱ/Ⅲ、Ⅴ和Ⅵ层均有显著性差异(P0.05);(MD+Tau)组与N组比较,Ⅴ和Ⅵ层均有显著性差异(P0.05),Ⅱ/Ⅲ层和Ⅳ层无显著性差异(P≥0.05)。见表1。 2.2.2 两组比较 (MD+Tau)组、N组分别与MD组比较,均有显著性差异(P0.05);(MD+Tau)组与N组比较,无显著差异(P≥0.05)。见表2。 2.2.3 视觉皮质中的nn阳性元音树突的长度 MD组与N组比较有显著性差异(P0.05);(MD+Tau)组与MD组和N组比较,均无显著性差异(P≥0.05)。见表2。 2.2.4 外侧膝状体背核的nnos阳性神经密度 N、MD及(MD+Tau)3组两两比较,均具有显著性差异(P0.05)。见表3。 3 讨论 3.1 单眼剥夺大鼠csad 生命早期视觉经验对于维持视功能的神经组织发育是至关重要的,视觉剥夺可导致视系统内部神经元联结重组,使剥夺眼机能分离、生理功能丧失。本实验显示在大鼠视觉发育关键期(生后14～45天)缝合一眼导致本应由剥夺眼所优势支配的对侧视中枢因视网膜-膝状核突触退化而发生皮层和皮层下区域中NOS活性下降、NO合成减少,出现明显的弱视效应,说明单眼剥夺大鼠是一个研究视觉发育可塑性和弱