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广东地区家庭聚集性登革热患者血清中登革病毒的鉴定 登吉热是由登吉病毒（df）引起的一种急性感染疾病，通过蚊子传播。它主要流行于亚热带和亚热带地区。随着世界气温的变化和航空航行的发展，登吉热成为热带和亚热带地区的严重公共卫生问题。登革病毒归属于黄病毒科中的黄病毒属,为单股正链的RNA病毒,全长基因组约11 kb,可分为4个血清型(DENV-1、DENV-2、DENV-3、DENV-4)。病毒基因组RNA可分为5’非编码区、结构蛋白编码区、非结构蛋白编码区以及3’非编码区四个部分,结构蛋白编码区和非结构蛋白编码区的基因序列为:5’-C-PreM-E-NS1-NS2a-NS2b-NS3-NS4aNS4a-NS4b-NS5-3’。在本研究中,我们对今年广东的3例家庭聚集性登革热病例进行了血清学检测及登革病毒的培养分离和鉴定,以期为预测广东登革热的流行趋势和进一步研究登革热的发病机制提供病原学依据。 1 材料和方法 1.1 同一家庭,不同旅行 3名患者均为今年我院8月6日收治的病人,家住广州,来自同一家庭,发病半个月前均没有到过东南亚等登革热流行地旅行。血清标本均为患者入院时所采集的。 1.2 igg抗体检测 胶体金法检测患者血清中登革特异性的IgM、IgG抗体,采用澳大利亚的PanBio Brisbane公司生产的Dengue Duo Cassette试剂盒,按说明书进行操作。 1.3 逆转录pcr 采用QIAamp Viral RNA Mini Kit试剂盒,分别取3例患者血清140μl提取病毒RNA,得到含病毒RNA液50μl,然后采用TAKARA RAN PCR Kit试剂盒按说明书进行逆转录,取1μl病毒RNA液为模板,加入AMV 0.5μl(5U/μl)、MgCl22μl(25 mol/L)、随机引物0.5μl(50 pg/μl)、5×RT-buffer 1μl、加无RNA酶的双蒸水至10μl,按30℃10 min,42℃30 min,99℃5 min,5℃5 min的顺序将其逆转录为cDNA,-20℃保存备用。 1.4 pcr扩增登皮病毒专用段 1.4.1 巢式pcr内引物及特异性pcr内引物 参考Lanciotti等所用的方法,针对C-prM基因区设计四型通用的巢式PCR外引物(D1和D2)及各型特异性的巢式PCR内引物(DENV-1:D1和TS1;DENV-2:D1和TS2;DENV-3:D1和TS3;DENV-4:D1和TS4),各引物序列和扩增片段如下表。 1.4.2 pcr的表达 第一轮PCR:采用TAKARA RAN PCR Kit试剂盒进行,取之前准备好的病毒10μl cDNA液,再加入Taq酶0.25μl(5 U/μl)、引物D1和D2各0.5μl(10pg/μl)、5×PCR buffer 10μl、加灭菌双蒸馏水至50μl体系。PCR的反应条件为94℃预变性5 min;94℃30 s,55℃30 s,72℃30 s,共40个循环;最后72℃延伸10 min。结束后分别取10μl PCR产物进行电泳分析。第二轮PCR:取上述PCR产物0.5μl为模板,采用TIANGEN PCR试剂盒,用登革病毒型特异性的引物进行第二轮PCR,具体方法为:1型登革病毒特异性引物为D1和TS1各0.5μl(10 pg/μl),2×Master Mix 25μl,加无菌双蒸水至50μl体系;2型引物为D1和TS2;3型为D1和TS3;4型为D1和TS4。PCR的反应条件为94℃预变性2 min;94℃30 s,55℃30s,72℃30 s,共35个循环;72℃延伸10 min。PCR产物经1.5%的琼脂糖电泳后,紫外光下观察电泳结果并摄像。 1.5 细胞培养及血清培养 我们对还处于发热期(发病第5天,体温38℃)的一名患者的血清进行了病毒分离培养。方法如下:取我院实验室保存的C6/36细胞株,复苏后进行培养传代,取1 ml密度为1×105个/ml的C6/36细胞种于12孔细胞培养板,置于28℃、5%的CO2培养箱中培养(培养液为:DMEM+10%胎牛血清+青链双抗)。待细胞长成单层后吸去培养液,PBS洗2遍后加入稀释20倍的患者血清200μl置于37℃、5%的CO2培养箱种吸附1 h,每15 min震荡一次,然后吸去血清加入细胞维持液(DMEM+2%胎牛血清+青链双抗)置于37℃、5%CO2培养箱继续培养,板孔设阴性对照。每天观察并记录细胞病变情况。 1.6 pcr产物的测量序列和环境分析 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis)进行比对及进化树分析。 2 结果 2.1 igm对革兰氏病毒性igm和igg抗体的检测 3名患者血清登革IgM抗体均为阳性,而IgG抗体均为阴性。 2.2