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眼皮肤白化病患儿yr基因分型及基因型分析 眼皮肤白化病（oca）是一组由黑色素合成相关突变引起的正常染色体遗传疾病，包括眼、皮肤和头发不足引起的共线性黑色素。根据致病基因的不同, OCA分为4型, 分别是酪氨酸酶 (tyrosinase, TYR) 基因突变导致的OCA1, P基因突变导致的OCA2, 酪氨酸酶相关蛋白1 (tyrosinase related protein-1, TYRP1) 基因突变产生的OCA3, 以及膜相关转运蛋白 (membrane-associated transporter protein, MATP) 基因突变所致的OCA4。其中OCA1和OCA2为眼皮肤白化病的最常见类型。 我们在对数名OCA患者进行分型研究中, 发现并鉴定了一种新的OCA1致病性突变—TYR基因错义突变C24Y。现简报如下。 对象和方法 1. 外部婚配型 先证者, 男, 3岁, 汉族。皮肤和毛发均为白色, 虹膜灰白色, 畏光, 眼球震颤, 视力低下。该家庭中其他人表型正常, 先证者父母非近亲婚配。正常对照样本为随机抽取的群体中无亲缘关系且无白化病表型者的DNA样本。 2. 方法 (1) dns提取 用北京鼎国生物技术公司DNA提取试剂盒提取DNA。 (2) pcr扩增 引物扩增范围包括TYR基因全部5个外显子、外显子-内含子交界区及3′端和5′端非翻译区。引物由上海英骏生物技术公司合成。 (3) dna的测序及序列测定 先证者TYR基因的PCR产物纯化后直接测序;对所发现的DNA序列改变经反向测序核实后, 进一步对其父母相应片段进行序列测定。测序工作由上海英骏生物技术公司完成。 (4) pcr引物pcr扩增 参照文献介绍的基本原理, 针对本研究发现的新突变C24Y, 设计双错配引物PCR/限制性内切酶分析法的PCR引物。用此方法检测100名对照者TYR基因是否存在C24Y突变。 结果 1. pcr扩增结果 TYR基因各扩增产物, 经1.5%琼脂糖凝胶电泳, 在紫外光下均呈良好条带。 2. s129s基因突变 先证者TYR基因第1外显子和第2外显子分别检测到C24Y和R299S突变, 见图1。对先证者父母的测序结果显示, 其父亲为C24Y突变的杂合子, 其母亲为R299S突变的杂合子。先证者TYR基因其它3个外显子未见DNA序列改变。 3. c24y基因突变 先证者与其父亲的PCR产物被内切酶NdeI切割后, 显示407bp和388bp 两条带, 为C24Y突变杂合子;其母亲和正常对照者只有一条407bp条带, 无C24Y突变。对100名随机抽取的群体中无亲缘关系且无白化病表型者进行检测, 未见TYR基因C24Y突变。 关于c24y基因突变 各型OCA均为常染色体隐性遗传病, 如果在特定基因内检出1对致病性突变, 则可从基因水平确定其属于OCA的哪一型。本研究在先证者的TYR基因上检出2个不同的致病性突变, 因此可确定为OCA1。 在先证者TYR基因第1外显子和第2外显子分别检测到C24Y和R299S突变, 前者导致TYR蛋白第24位半胱氨酸 (Cys) 残基被酪氨酸 (Tyr) 残基取代, 后者导致第299位的精氨酸 (Arg) 残基被丝氨酸残基 (Ser) 置换。TYR基因突变使得酪氨酸酶结构和功能异常, 导致白化症状的发生。 本研究中, 先证者TYR基因第1外显子检测到的C24Y突变, 经检索国际白化病中心的白化病突变数据库及近3年中、英文相关文献, 均未见有关该突变的研究报道。双错配PCR/限制性内切酶分析法研究结果, 先证者与其父亲的PCR产物被内切酶NdeI切割后, 显示407bp和388bp 两条带, 其母亲只有一条407bp条带, 与预期结果完全一致, 证明C24Y突变的错配PCR/内切酶分析法准确可靠;而对100名无该病表型者 (200个TYR等位基因) 第24位密码子所在的PCR产物进行NdeⅠ酶切分析, 未发现C24Y突变等位基因。此结果表明, C24Y突变不是一般意义上的DNA序列多态性变异, 极可能是一种致病性突变。 综上分析, 我们对一名中国大陆OCA患者及其父母进行了TYR基因突变分析, 在基因水平确定该患者为OCA1, 发现并鉴定了一种TYR基因新的致病性突变。