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绿原酸对过氧化氢诱导大鼠髓核细胞凋亡的影响 脊柱退行性改变对下腰痛的症状在临床上非常常见。下腰痛的原因有很多，但腰椎退行性变化是重要因素之一（1.2）。目前腰椎间盘退行性改变的病因及病理生理机制尚不完全清楚, 但多数相关研究表明椎间盘的退变起始于髓核组织〔3，4〕。髓核细胞 ( NPCs) 的减少引起细胞外基质合成的减少和成分的改变, 是导致椎间盘退行性改变的病理基础, 而髓核细胞过度凋亡是导致椎间盘细胞减少的直接原因〔5，6〕, 缺氧所造成的氧化应激是造成细胞凋亡的重要环节〔7〕。如何提高髓核细胞对缺氧引起凋亡的防御能力而降低凋亡率已成为目前研究的热点。笔者前期的研究已证明, 一定浓度的绿原酸能对抗过氧化氢 ( H2O2) 引起的髓核细胞凋亡〔8〕。但目前绿原酸对氧化应激条件下NPCs凋亡的作用机制尚不清楚。本研究使用H2O2600 μmol/L模拟体内氧化应激环境, 基于与凋亡相关的PI3K / Akt信号转导途径深入研究绿原酸对过氧化氢诱导的NPCs保护作用的分子机制。 1 材料表面 1.1 实验动物 1.2 药物和试剂 2 方法 2.1 细胞培养和实验组 2.2 流式细胞术检测细胞坏死 2.3 流式细胞术检测细胞内的ros 2.5 统计处理 3 结果 3.1 gac对p22诱导下大鼠髓核细胞死亡的影响 3.2 gaca对p22诱导下大鼠骨髓ros的影响 3.3 gaca对p22诱导下大鼠骨髓p-akt和bcl-2的发现的影响 4 绿原酸对引起髓核细胞凋亡的大鼠ns-3,其符合pi3k/akt信号通路来保护细胞细胞外在表达,是一种有规划的抗凋亡剂 目前为止, 较多研究已证实缺氧环境可诱导细胞凋亡, 缺氧所造成的氧化应激是造成细胞凋亡的重要环节〔7〕。本实验采用H2O2处理NPCs后, 流式细胞仪检测其凋亡率显著增高, 提示NPCs难以在氧化应激环境下存活。而CGH能使凋亡率显著下降。 大量的研究表明, 活性氧簇是由线粒体呼吸而不断产生的副产物, 在较低的浓度下参与细胞的氧化代谢过程, 维持着细胞正常的生理功能, 并在细胞存活和凋亡的调控中起着关键作用。然而, 在高浓度情况下时反而会攻击线粒体而诱导细胞凋亡〔9，10〕, 可能是ROS导致线粒体跨膜电位的改变, 凋亡分子的释放和Caspase依赖的细胞凋亡的启动〔11〕。在本实验中: 氧化应激诱导NPCs后, 细胞内ROS显著增高, 绿原酸加入后显著降低氧化应激损伤后的NPCs内ROS含量, 结果表明绿原酸可能通过降低ROS生成和清除细胞内ROS的累积而实现抗凋亡的作用。 PI3K / Akt信号通路在许多重要的细胞过程中起着至关重要的作用, 其最显著的作用是调节细胞凋亡过程, 能够抑制细胞凋亡〔12，13〕, 可通过磷酸化Akt来调节促凋亡及抗凋亡因子的平衡来发挥抗凋亡的作用〔14〕。在本研究中, 笔者观察到暴露于氧化应激环境中的Akt处于低水平的磷酸化, 而绿原酸可以使细胞磷酸化Akt水平增加。这表明, 绿原酸通过PI3K/Akt信号转导通路来抗NPCs凋亡。此外, 笔者发现PI3K/Akt特异性抑制剂 ( LY294002) 可以阻断绿原酸的保护作用。另外也发现绿原酸抑制ROS的作用可以由LY294002阻断, 这提示绿原酸依赖PI3K/Akt通路来抑制ROS生成和清除ROS。这些结果与以往研究表明PI3K / Akt通路可以抑制细胞内ROS水平的增加相一致〔15，16〕, PI3K/ Akt通路的激活可能导致p38β 活性的增加, 然后p38β 便抑制了ROS〔15〕, 进一步的研究需要探寻其过程的精确机制。 以往的研究表明, BCL-2定位于线粒体膜上, 是PI3k / Akt下游的抗凋亡蛋白, 起着调节细胞凋亡的作用〔17〕。BCL-2家族成员蛋白的失衡可以通过内源途径触发细胞凋亡〔18〕。本课题组前期研究通过RT-PCR证实绿原酸可以上调BCL-2转录水平表达〔8〕, 为了进一步证实该作用, 笔者进一步采用Western blot对BCL-2蛋白水平进一步检测。在本实验中, 用绿原酸预处理后能够提高BCL-2蛋白在氧化应激下的表达, 但该作用被LY294002阻断。 Bagchi等〔19〕发现PI3K/Akt信号通路参与了抗氧化剂对细胞保护的机制以及BCL-2基因表达的调控, 本研究表明, 绿原酸能够通过PI3K/Akt信号通路来增加BCL-2蛋白的表达以及保护髓核细胞免受氧化应激的损伤。 综上所述, 绿原酸对H2O2诱导的大鼠NPCs凋亡具有保护作用, 该作用与激活PI3K/Akt途径相关, 通过激活该途径可抑制活性氧簇的生成, 增加抗凋亡BCL-2因子的表达来发挥其抗凋亡的作用。 因此, 笔者认为: 绿原酸在阻止或延缓髓核细胞进一步退变的过程中是一种很有