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荧光假单孢菌pseudomonsgm5-1a对松树脂氧和酶活性的影响 松材线虫burphelenchusxylophilus主要传播到松褐草群落，危害黑松丝菌、松茸p.massonic等各种树木，具有很危险的营销潜力和可扩展性。对该病害的系统研究,在国外仅有几十年的历史,在我国自发现该病害的20 a里,虽然做了大量的研究工作,但对该病的致病机理仍然知之较少。Oku等首次报道松材线虫的致萎毒素与松材线虫携带的细菌有关,Kuwazu从松材线虫体表分离到3种芽孢杆菌,并且可以产生致萎活性物质。洪英娣等也对松材线虫携带的细菌进行了鉴定,并证明其具有一定的产毒能力。Boguang ZHAO等报道了松材线虫携带的致病细菌的致病性和在致病松树中的分布情况。为了确定松材线虫携带细菌毒素是否具有广谱性并为了进一步弄清其致病机理,在实验中研究了松材线虫携带的一株细菌荧光假单孢Pseudomonas fluorescensGcM5-1A毒素液对4种作物生长的影响和对黑松脂氧和酶(lipoxygenase)活性的影响。现报道如下。 1 材料和方法 1.1 orescensbiolgm5-a与gcm5-a 测试用的黑松采自徐州,荧光假单孢菌P.fluorescensbiotype GcM5-1A由南京林业大学森林与环境资源学院提供。玉米、小麦、木耳菜和油麦菜的种子购自徐州种子站。 1.2 方法 1.2.1 细菌毒素原液的制备 将培养7 d的细菌培养液离心10 min(4 000 r/min),取上清液用0.22 μm微孔滤膜过滤,得到细菌的毒素原液,置于4 ℃冰箱保存。 1.2.2 细菌毒素的测定 将玉米、小麦、木耳菜和油麦菜种子萌发的小苗浸泡在细菌毒素原液中,每种作物3个重复,以清水处理作对照,置于光照培养箱中,观察毒素的致病现象,感染指数在出现发病症状的第2天计算。 1.2.3 lox酶提取液及底物配置 将松针浸泡在细菌毒素原液、稀释5倍的菌液和不含菌液的水中,各3个处理,每个处理3个重复,放在光照培养箱中,分别在6、12、18、24、36 h测定酶活性。测定过程参考了Surrey的方法。取0.2 g不同处理的松针,加2 mL 0.2 mol/L pH6.5的磷酸缓冲液配置的1%(W/V)聚乙烯吡咯烷酮(PVP),冰浴研磨,4 ℃ 10 000 r/min离心20 min,上清液即为LOX酶提取液。 底物配置:将0.25 mL Tween-20溶于5 mL 0.2 mol/L的硼酸缓冲液(pH9),逐滴加入亚油酸0.25 mL,充分混匀使其呈乳浊液,再逐滴加入0.75 mL 1 mol/L NaOH,直至混合液澄清,然后加45 mL 0.2 mol/L硼酸缓冲液(pH9),再用双蒸水定容至100 mL,此时亚油酸浓度约为7.5 mmol/L,最后用浓HCl调溶液为pH6.5。 取50 μL酶液和0.5 mL底物混合,混合液在25 ℃水浴中保温15 min,加2.4 mL无水乙醇终止反应,取出0.5 mL用硼酸缓冲液稀释至4 mL,于酶标仪(Bio-rad Model 550)234 nm处,测OD变化值。对照将50 μL酶液换成酶提液,其他条件相同。 2 结果与分析 2.1 玉米病害症状观察 油麦菜在该毒素处理后第2天开始出现病状,小麦和木耳菜在第3天开始出现病害症状,玉米第4天表现出病害症状,对照没有出现病害症状,结果见表1。从表1可以看出,荧光假单孢菌P.fluorescensGcM5-1A产生的毒素对多种植物都具有毒性,说明此毒素不是专一性毒素。 2.2 单带酪氨酸酶lox对松针脂氧和酶活性的影响 由图1可看出原液处理的LOX活性在处理后的18 h达到高峰,随后逐渐下降;稀释5倍处理的在6～12 h呈上升趋势,之后逐渐下降。 3 质中lox活性的变化 通过实验结果看出荧光假单孢菌毒素对4种作物处理后均产生萎蔫和枯死现象,表明这种毒素对多种植物都有毒害影响,因此可推论该菌毒素具有一定的广谱毒性。 脂氧和酶是一种含有非血红素铁的蛋白质,在生物体中广泛存在,植物中膜脂富含的亚油酸和亚麻酸是主要的反应底物。许多研究表明,植物受到有害物质侵染发生过敏性坏死时,细胞膜的破坏源于膜脂的过氧化反应。膜脂的过氧化反应可产生活性氧和自由基,从而诱导有关活性氧代谢的一些酶类的活性发生变化。Keppler等发现有害物质的侵染可以诱导植物体内LOX活性增高,原因可能是引发活性氧突发和膜脂过氧化,造成其作用底物不饱和脂肪酸浓度增高。当该菌毒素浓度较高时会引起LOX活性增高,原液处理的在18 h达到最高值与稀释5倍和对照处理的值差异显著,之后逐渐降低。稀释5倍的处理LOX活性升高后下降趋势较明显,可能是由于浓度大的毒素液对细胞的破坏较严重,浓度小的破坏程度弱,经一定时间