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快速液相色谱lq-orbirap质谱联用技术分析茯苓中的化学成分

椰子是多孔科的一种杏仁菌核。它来自《神农本草经》。俗称云岭、松岭、玄灵，主要产于云南、安徽、湖北等地。茯苓具有利水渗湿,健脾化痰,宁心安神,败毒抗癌之功效,主要用于治疗水肿、痰饮、脾虚泄泻、心悸失眠证。现在药理研究表明,茯苓有利尿、镇静、抗肿瘤、降血糖、增加心肌收缩力的作用。通过现代植化手段从茯苓干燥菌核中分离得到的化合物主要为羊毛甾烷型三萜,根据母核类型不同分为2类,一类为闭环型羊毛甾烷型,另一类为裂环羊毛甾烷型,根据17位上取代基侧链双键位置的不同,每一类型又分为2种亚型。

线性离子阱与Orbitrap傅里叶扫描质谱组成的串联质谱仪(LTQ-Orbitraphybridmassspectrometry)是近年发展起来的一项新的质谱联用技术,其通过将线性离子肼的多级质谱功能以及Orbitrap的高分辨能力结合起来,可实现多级质谱碎裂和母离子的高分辨采集,从而为小分子药物的鉴定与分析提供更多信息。本研究拟将其与快速液相色谱结合用于茯苓95%乙醇提取物中的成分鉴定与分析,为对其活性成分的进一步分析提供基础。

1仪器、试剂和仪器

ThermoScientificLTQ-OrbitrapXL组合式高分辨质谱仪(美国赛默飞公司),Ultimate3000RS液相色谱仪(美国戴安公司),BP211D1/10万电子天平(德国赛多利斯公司),XW-80A漩涡混合仪(上海青浦泸西分析仪器厂)。

乙腈、甲醇、甲酸为色谱纯(MERCK公司),水为超纯水(由Millipore纯水机制得),其它试剂为分析纯。茯苓酸(购自四川省维克奇生物有限公司,批号:120316),对照品质量分数均大于98%。茯苓药材(批号:120203)购自南京市交通医院,经南京中医药大学刘圣金博士鉴定为正品。

2方法和结果

2.1流动相梯度洗脱

色谱柱:ThermoHypersilGoldC18(3μm,150mm×2.1mm),进样量5μL,流速0.3mL/min,柱温40℃;流动相0.1%甲酸水(A)-乙腈(B)梯度洗脱,洗脱程序如下:0~3min,A:90%;3~35min,A:90~28%;35~38min,A:28%;38~40min,A:28%~90%;40~43min,A:90%。

2.2测试温度及质量范围

离子化方式:ESI(-);管状透镜电压(TubeLens):80.00V;毛细管电压(CapillaryVoltage):30.00V;毛细管温度(CapillaryTemp):200.00℃;蒸发器温度(APCIVaporizerTemp):300.00℃;鞘气流(SheathGasFlow):40.00arb;辅助气流(AuxGasFlow):10.00arb;质量分析器:FTMSOrbitrap;质量范围(m/z):200.0~1300.0;碰撞能量:35。所有数据均采用Ultimate3000RS和ThermoXcaliburQualBrowser采集处理。

2.3溶液制备

2.4生成[m-h]-峰

LTQ-Orbitrap分析茯苓酸标准品负离子模式下的总离子流图谱如图1所示。由图可知,茯苓酸的保留时间约为36.33min。

茯苓酸在负离子一级质谱中多生成[M-H]-峰。在一级质谱中,具有m/z527.3723的[M-H]-峰,可以推测其相对分子质量为528,对m/z527.3723[M-H]-二级质谱进行分析可得到m/z509.36[M-H-H2O]-、m/z465.40[M-H-H2O-CO2]-、m/z405.41[M-H-H2O-CO2-CH3COOH]-、m/z423.34[M-H-H2O-CO2-C3H6]-等二级碎片离子,通过对其碎片离子进行归属,推断其可能的碎裂途径如图2所示。

2.5裂环型羊毛哌烷的结构鉴定

茯苓中化合物主要为羊毛甾烷型三萜,根据母核类型不同分为2类,一类为闭环型羊毛甾烷型,另一类为裂环羊毛甾烷型,根据17位上取代基侧链双键位置的不同,每一类型又分为2种亚型。通过对F35号峰进行一级质谱分析,发现母离子及碎裂离子信息与茯苓酸的碎裂信息一致,且保留时间也与其一致,可以据此判断F35号峰为茯苓酸。其他闭环型羊毛甾烷也可通过其碎裂信息进行推断进而推测其可能的结构。

对于裂环型羊毛甾烷类化合物,我们以F12号峰为例,通过对其一级质谱分析,可见其具有m/z483.31[M-H]-的准分子离子峰,可以推测其相对分子质量为