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远隔缺血后处理对脑缺血再灌注损伤的保护作用

近年来，相关研究人员先后提出了缺血预处理（ip）、缺血治疗（ipc）、远端缺氧预处理（rip）和ripc的概念，这些处理方法可以发挥内源性机制对cir损伤的保护作用[1.4]。

微管相关蛋白质1轻链(MAP1-LC3)是哺乳动物自噬体形成相关蛋白,当哺乳动物细胞发生自噬时,细胞内LC3的含量及LC3-I向LC3-II的转化均明显增加。通过检测细胞内LC3表达变化,可以方便地判断细胞状态,判断其自噬是被诱导还是被抑制。自噬体形成后,溶酶体与之融合,释放溶酶体酶,将自噬泡中的蛋白质和细胞器消化溶解;Ellis等人报道,缺血CathepsinB的小鼠有神经元丢失,脑萎缩等现象的出现,说明CathepsinB能维持中枢神经系统的正常功能。

本文采用了大鼠脑缺血再灌注(CIR)模型,检验RIPC对CIR的保护作用,比较后处理和模型组LC3和CathepsinB表达的差异性,旨在阐述自噬-溶酶体在RIPC对CIR的影响中的作用,为RIPC对CIR的保护机制提供新的线索。

1材料和方法

1.1自由饮水,不在2h

清洁健康雄性SD大鼠42只,体重210~260g,由哈尔滨医科大学第二临床医学院实验动物中心提供。术前12h禁食,自由饮水。将SD大鼠随机分为5组:假手术组(Sham,n=10),缺血再灌注3h组(I/R3h,n=6),缺血再灌注24h组(I/R24h,n=10),缺血再灌注3h+下肢缺血后处理组(RIPC3h,n=6),缺血再灌注24h+下肢缺血后处理组(RIPC24h,n=10)。

1.2试剂和试剂盒

一抗LC3购自sigma公司;CathepsinB购自武汉博士德试剂公司;二抗试剂购自北京中杉金桥公司PV6001;DAB试剂盒购自北京中杉金桥公司ZLI9031;2,3,5-氯化三苯四氮唑(TTC)购自sigma公司。

1.3颈总动脉清核

模型组和处理组缺血再灌注均采用Longa法制备大鼠局灶性脑缺血-再灌注模型,用10%水合氯醛(0.35ml/100g)腹腔麻醉,仰卧位固定于手术台上,颈部正中纵向切口,暴露右侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉,分离右侧颈总动脉,在靠近颈外动脉根部结扎颈外动脉,近心端结扎颈总动脉,血管夹夹闭其远端,并在结扎线和血管夹之间的颈总动脉上剪一小口,切口远心端打一松口,将尼龙线自剪口处插入,缚紧缺血远端的丝线,松开血管夹,经颈总动脉分叉处通过颈内动脉到大脑中动脉开口处,至有阻力不能再进为止,插线长度约18~20cm(从分叉处算)。剪断线头、缝皮。假手术组不进线外,其余过程同缺血组。正常组不干预。在灌注组在缺血90min后轻轻抽出鱼线至有阻力感,表明线头已退出至颈总动脉剪口处。术中保持动物肛温37℃左右。

1.4动脉夹夹闭股动脉

分离大鼠双侧股动脉主干,在缺血即刻使用动脉夹夹闭股动脉15min,再放开15min,重复3次。假手术组和对照组仅分离股动脉,不做任何处理。

1.5大鼠神经功能损伤程度检测

麻醉苏醒后,将动物放回鼠笼,自由饮食。参照Garcia评分法,各组CIR后24h采用双盲法进行神经功能评分。Garcia评分从大鼠自主运动、体态对称性、前肢伸展功能、网屏实验、身体双侧触觉、双侧胡须反射等6方面评定大鼠神经功能损伤程度;功能正常时得分最高,18分;功能损伤最严重者得分最低,3分(见表1)。

1.6脑梗死区的染色

假手术组,缺血再灌注24h组,缺血再灌注24h+下肢缺血后处理组随机取4只鼠进行TTC染色。鼠再灌注24h后,过量麻醉致死,断头取脑,用生理盐水冲洗后放于-20℃冰箱冷冻20min;将脑沿冠状面切4刀,切成5片,迅速将脑片置10ml的1%的TTC溶液中,放入37℃温箱15~30mim,其间每10min翻动一次,经染色后,正常脑组织呈玫瑰红色,而脑梗死区呈白色。将染后的脑组织置10%的福尔马林溶液中固定24h。固定后拍照,用电脑图像分析系统(ImageProplus6.0)测定脑梗死体积。

1.7免疫组化染色

各组鼠被过量麻醉致死后,断头取脑进行24h、4%多聚甲醛固定,自视交叉向前后2mm切取冠状脑片,取脑片,常规脱水、透明、石蜡包埋和切片,作HE染色和免疫组化染色。

1.8u3000结论

切片常规脱蜡至水;蒸馏水洗净后柠檬酸微波修复15min,自然冷却至室温,PBS洗;3%过氧化氢孵育10min,以阻断内源性过氧化物酶,PBS洗;10%BSA封闭10min;滴加一抗(LC31∶400,CathepsinB