中华绒螯蟹部分基因组文库构建和微卫星位点的筛选.pdfVIP

中国农业生物技术学会2008水产生物技术专题研讨会 中华绒螯蟹部分基因组文库构建和微卫星位点的筛选 毛瑞鑫L2，鲁翠云1，常玉梅1，梁利群1，孙效文1 1．中国水产科学院黑龙江水产研究所，哈尔滨150076； 2．上海海洋大学生命科学与技术学院，上海200090 摘要：本实验利J{j磁珠富集和生物素筛选相结合的办法构建了中华绒螫蟹基冈组微卫星富集 文库。J}】同位素探针对文库进行第二次筛选鉴定，获得含微卫星的阿l性克隆。以中华绒螫蟹为实 验材料，提取肌肉的基冈组DNA，经Sua3A I限制性内切酶酶切后，同收400．1000bp的片段进行 PCR伞基因组扩增，并利用生物素标记的(GA)12探针进行微卫星片段的富集。将得到的片段与 pGEM．T载体连接后转A,DH5a大肠杆菌中，然后利用，2P同位素标记的(GA)12探钊‘进行第二次筛 选。结果，共获得微卫星基因组文库1500个菌，杂交前菌落PCR检测阳性克隆率62．5％；杂交后 得到的阿I性克隆为447个，占29．8％。经测序，有248个克隆含有重复次数大_丁．5次的微卫星序列。 在得剑的微卫星序列中，重复单元除GA／CT外，还观察到三碱基、四碱基重复单元。根据侧翼序 列应用引物设计软件Primer3．0设计引物164对，选择合成50x,)，通过优化PCR反应条件，结果有21 对引物可扩增fI{清晰可重复的目的条带，15对具有多态性。术研究对巾华绒蛰蟹基因组资源的开发 利川起到一定的促进作J{j，并为中华绒整蟹种群的遗传结构、种质资源利J}J与保护、遗传连锁图 谱的构建、QTL定位及对其进行更深入的研究提供了基础资料。 关键词：中华绒螫蟹，微卫星，磁珠富集 FractionalGenomicLibrariesand Constructing Screening MicrosatellitesDNAofChinesemitten sinensis)者 crab(Eriocheir Mao Xiaowenl” Ruixinu，Lu Cuiyunl，ChangYumeil，LiangLiqunl，Sun Scienceand Ocean 1．CollegeofAqua-LifeTechnology,Shanghai RiverFisheriesResearch of Sciences，Harbin，1 2．Heilongjiang Institute，ChineseAcadamyFishery 50076，China Abstract：Inthis DNAswereisolatedfromChinesemittencrab experimert，microsatellite biotin methodandradioactive capture labeling (Erioche打sinensis)genomebycombining hybridization． Chinesemitten DNAwasextractedfromthemuscleofChinesemitten crab(Eriocheirsinensis)genomic craband withrestrictionSau3A 400—1000 wererecoveredand digested enzyme I，and