不同类型脂肪酸对3T3-L1脂肪细胞脂联素及其受体表达影响.docxVIP

脂联素受体２（Ｒ２）下游引物５’ＣＡＧｃＡｃＡ—ＣＡＧＡＴＧＡｃＡＡＴＣＡ３’，ＰｃＲ产物为３０４ｂｐ。Ｂ—ａｃｔｉｎ上游引物５’－ｃｃＡＧＧＧＴＧＴＧＡＴＧＧＴＧＧＧＡＡＴＧ一３７；Ｂ—ａｃｔｉｎ下游引物５’一ＣＧＣＡＣＧＡＴＴＴＣＣＣＴＣＴＣＡＧＣＴＧ－３７，ＰＣＲ产物为５１０ｂｐ。１５．其他：均为国产分析纯。二、溶液配置１．ＤＭＥＭ培养液：取ｌ包（１０９）ＤＭＥＭ培养基粉剂，加入ＮａＨＣ０３３．７９，溶于１０００ｍｉ双蒸水中，搅拌充分溶解，调ｐＨ至７．２，Ｏ．２２ｕｍ滤膜，负压抽滤灭菌，取少量培养液于细胞培养箱中７２ｈ孵育检菌，其余４１２保存备用。临用前，加入灭菌二抗即青霉素（终浓度１００Ｕ／ｍ１），链霉素（终浓度１００Ｕ／ｍ１），及加入小牛血清或胎牛血清使其终浓度为１０％。２．青霉素，链霉素：各８０万单位溶解于无菌的８０ｍｌ的双蒸水中，使其终浓度各为１００００单位／ｍｌ，分装为ｌｍｌ后－２０１２保存。３．盐缓冲液（ＰＢＳ）：称取８．００９ＮａＣＩ，Ｏ．２０９ＫＣＩ，１．４４９Ｎａ２ＨＰ０４Ｏ．２４９ＫＨ２Ｐ０４溶于１０００ｍｌ双蒸水中搅拌溶解完全，调ｐＨ至７．４，高压灭菌后４１２保存备用。４．３一异丁基－１－甲基黄嘌呤溶液配制：３－异丁基－１－甲基黄嘌呤溶解于双蒸水中，用碱性溶液（ＩＯｍｏｌ／ＬＮａＯＨ溶液）助溶解，使其终浓度为５０ｍｍｏｌ／Ｌ，一２０１２保存，两周内使用。５．地塞米松溶液配制：地塞米松按照ｈｗＪｎ：ｌｌ溶解于无水乙醇中，抽滤灭菌，一２０１２保存。６．诱导剂：在含１０％胎牛血清的ＤＭＥＭ培养基中加入分别加入胰岛素，地塞米松，３一异丁基一卜甲基黄嘌呤溶液使其终浓度分别为ｌＯｕｇ／ｍｌ，０．２５ｕｍｏｌ／Ｌ，０．５ｍｍｏＦＬ。７．胰岛素培养液：在含１０％胎牛血清的ＤＭＥＭ培养基中加入胰岛素溶液，使其终浓度为１０ｕｇ／ｍｌ。８．胰蛋白酶：Ｏ．５９胰蛋白酶溶解于配制好的２００ｍｌ的ＰＢＳ溶液中使其终浓度为０．２５％，搅拌均匀，０．２２ｕｒｎ滤膜，抽滤灭菌，４１２保存备用。３三、主要仪器１．二氧化碳孵箱：ＨｅｒａＣｅｌｌ２．超挣工作台：ＨｅａｌＦｏｒｃｅ３．倒置显微镜：ＯｎＭＰＵＳ４．ＰＥ２４００ＤＮＡ热循环仪：ＦＥＲＫＩＮＥＬＭＥＲ５．ＤｉｇｉｔａｌＳｃｉｅｎｃｅＩＤ凝胶成像分析系统：Ｋｏｄａｋ６．－８０℃深低温冰箱：ＢｕｆｆｅｒＨｕｂｂａｒｄ７．Ｂｉｏｆｕｇｅ２８ＲＳ低温高速离心机８．ＨｅｒａｅｕｓＣｅｎｔｒｉｆｕｇｅ５４０３高速离心机９．Ｅｐｐｅｎｄｏｆ负压吸引器：ＳａｖａｎｔＶＬＰｌ２０ＰＥＥ１０．ＰＳ３０１电泳仪：Ａｍｅｒｓｈａｍｐｈａｒｍａｃｉａｂｉｏｔｅｃｈ１１．紫外分光光度仪：Ｈｅｗｌｅｔｔ．Ｐａｃｋａｒｄ１２，磁力搅拌机，恒温水浴箱，等均为国产。＾实验方法１．材料和试剂：３Ｔ３－ＬＩ脂肪细胞株由中国科学院生物化学和细胞生物学研究所赠送；ＤＭＥＭ细胞培养粉购自Ｇｉｂｃｏ公司；胎牛血清购自杭州四季青生物制品公司；重组人普通胰岛素购自Ｎｏｖｏ公司；地塞米松，３－异丁基一１一甲基黄嘌呤，ＰＡ，ＤＨＡ购自Ｓｉｇｍａ司；ＲＴ－ＰＣＲ试刺盒购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司，脂联素及其受体和ｐａｃｔｉｎ引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。２．３Ｔ３－Ｌｔ脂肪细胞的培养和诱导：将３Ｔ３．ＬＩ前脂肪细胞用含１０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ培养液在３ＴＣ、５％Ｃ０２的条件下培养，待细胞融合２ｄ后，加含Ｏ．５ｍｍｏｌ／Ｌ３－异丁基１．甲基黄嘌呤，０．２５ｐｍｏｌ／Ｌ地塞米松，１０ｕｇ／ｍｌ胰岛素、ＩＯ％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ培养４８ｌｌ’换以含１０ｐｇ／ｍ１胰岛素的培养液再培养４８ｈ，随后以１０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ培养液继续培养，诱导分化８～１２ｄ的３Ｔ３．ＬＩ细胞９０％多呈脂肪细胞表型，可用于研究。３．ＰＡ，ＤＨＡ对脂肪细胞脂联素及其受体表达的影响：将诱导好的脂肪细胞分别加入含ｌＯｇｇ／ｍｌ，３０耻ｇＪｎａ，５０肛ｇ／ｍｌＤＨＡ终浓度的培养液，培养４８小时观察ＤＨＡ对其脂联素及其受体表达的影响；加入含１００“ｍｏｌ／ｌ，２００９ｍｏｌ／ｌ，４００１ｕｎｏｌ／ｌＰＡ终浓度的培养液，培养４８小时观察ＰＡ对其脂联素及其受体表达的影响，均设空白对照组。４．总ＲＮＡ抽提及半定量ＲＴ－ＰＣＲ．．用半定量逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）检测脂联素及其受体ｍＲＮＡ的表达。应用Ｔｒｉｚｏｌ试剂盒提取诱导分化结束后的细胞总ＲＮＡ。用紫外分光光度计进行ＲＮＡ定量，用Ａ２６０与Ａ２８０的比值确定ＲＮＡ的纯度。脂联素及其受体和１３－ａｃｔｉｎ引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。脂联素上游引物５，－ＡＡＧＧＡＣＡＡＧＧＣＣＧＴＩ℃ＴＣＴ－３’：下游引物５¨吖Ⅱ℃ＧＧｌ：Ａ（ｎｒｒＧＣＡＧＴＣＡＧＴｒＧＧ．３’，ＰＣＲ产物为２２２ｂｐ。；脂联素受体ｌ（９１）上游引