斑马鱼ＳＡＡ蛋白原核表达、抗体制备及菌结合研究.docVIP

斑马鱼ＳＡＡ蛋白原核表达、抗体制备及菌结合研究-农学论文 斑马鱼ＳＡＡ蛋白原核表达、抗体制备及菌结合研究 齐 麟１，李 军２，向志明３，余英才４ （１．铁道警察学院，郑州 ４５００５３； ２．聊城大学药学院，山东 聊城 ２５２０００； ３．中国科学院南海海洋研究所，广州 ５１０３０１；４．江西中医药大学生物化学教研室，南昌 ３３０００４） 摘要：通过构建斑马鱼（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ）ＳＡＡ原核表达载体，在大肠杆菌（E.coli）ＴＢ１中诱导表达并纯化获得了斑马鱼ＳＡＡ融合蛋白，将纯化的斑马鱼ＳＡＡ蛋白免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠，制备了特异性多克隆抗血清，并研究了斑马鱼ＳＡＡ融合蛋白与细菌的结合能力及检测了抗体效价。结果表明，纯化的斑马鱼融合ＳＡＡ蛋白能够与５种细菌直接结合，血清效价达到１∶２ ０００以上。 关键词 ：斑马鱼（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ）；血清淀粉样蛋白Ａ；原核表达；抗体制备；菌结合 中图分类号：Ｑ７８９ 文献标识码：A 文章编号：0439－８114（２０15）02－0382-03 DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.02.031 血清样淀粉Ａ（Ｓｅｒｕｍ ａｍｙｌｏｉｄ Ａ， ＳＡＡ）为高度异质性蛋白［１］，因与一系列疾病相关而成为病理学研究的热点。ＳＡＡ基因的多态性是淀粉样病变的高危因素，持续高水平ＳＡＡ是淀粉样病变发生的前提条件［２］。除此之外，ＳＡＡ与胃癌［３］、直肠癌［４］、胰腺癌［５］、肺癌［６］和绒毛膜癌［７］等恶性肿瘤呈正相关，并将ＳＡＡ作为癌症临床常规检查的非特异性肿瘤标志物以及手术后康复程度的指标是可行的。人源ＳＡＡ可以通过ＮＦ－κＢ信号通路诱导细胞间黏附分子１（Ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ １， ＩＣＡＭ－１）的表达而募集白细胞［８］。本研究中在克隆获得全长斑马鱼（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ）ＳＡＡ的基础上［９］，构建融合表达载体，在大肠杆菌TB1中表达斑马鱼ＳＡＡ并进行纯化，将纯化蛋白进行菌结合试验并免疫Balb/c小鼠制备了特异性多克隆抗体，为后续免疫及肿瘤病理学试验打下基础。 １ 材料与方法 １．１ 试验材料 １．１．１ 载体与菌种 原核表达载体ｐＭａｌ－ｃ２ｘ、大肠杆菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）表达宿主菌ＴＢ１和Ａｍｙｌｏｓｅ Ｒｅｓｉｎ多糖树脂购自Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ公司；ｐＧＥＭ－Ｔ ｖｅｃｔｏｒ购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司；大肠杆菌ＤＨ５α、野生型大肠杆菌Ｋ１２、副溶血弧菌（Ｖ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、溶澡酸弧菌（Ｖ．ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）、金黄色葡萄球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）和表皮葡萄球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）均为铁道警察学院生化快速鉴别实验室常规保种。 １．１．２ 试剂 琼脂糖胶回收试剂盒和小量质粒提取试剂盒为Ｏｍｅｇａ公司产品；Ｔ４ ＤＮＡ连接酶、Ｔａｑ酶、ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ、限制性内切酶ＥｃｏＲⅠ和ＸｂａⅠ为宝生物工程（大连）有限公司产品；蛋白Ｍａｒｋｅｒ为Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司产品；碱性磷酸酶羊抗鼠ＩｇＧ购自美国安玛西亚公司；ＮＣ膜购自ＰＡＬＬ公司；其他试剂均为国产分析纯。 １．２ 原核表达载体pMal-c2x-SAA的构建 使用Ｐｒｉｍｅｒ ｐｒｅｍｉｅｒ ５．０软件设计上、下游引物，以ｐＧＥＭ－Ｔ－ＳＡＡ为模板进行ＰＣＲ扩增，其中上游引物序列：５′－ＴＴＴＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＡＧＣＴＴＣＴＴＣＴＴＧ －３′，下游引物序列：５′－ＴＴＴＴＣＴＡＧＡＴＡＴＧＧＧＣＡＧＧ ＣＣＴＴＴＡ－３′。ＰＣＲ反应程序为：９４ ℃预变性５ ｍｉｎ；９４ ℃变性２０ ｓ，５６ ℃退火３０ ｓ，７２ ℃延伸３０ ｓ，共３０个循环；７２ ℃延伸１０ ｍｉｎ。将ＰＣＲ扩增产物经琼脂糖凝胶回收试剂盒回收纯化后和ｐＭａｌ－ｃ２ｘ空载体质粒进行ＥｃｏＲⅠ和ＸｂａⅠ双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳回收纯化后于１６ ℃连接过夜，并将连接产物转化原核表达宿主菌ＴＢ１，－８０ ℃保菌。 １．３ 重组质粒ｐＭａｌ－ｃ２ｘ－ＳＡＡ的诱导表达及纯化 取“１．２”中的菌液０．５ ｍＬ接种到５ ｍＬ含氨苄青霉素的新鲜ＬＢ液体培养基中，３７ ℃过夜培养后，转接到５００ ｍＬ的新鲜培养基中，继续３７ ℃培养至ＯＤ６００ ｎｍ＝０．６，加入０．１ ｍｍｏｌ／Ｌ的ＩＰＴＧ诱导３ ｈ以上，以１２％的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳分析其表达后利用Ａｍｙｌｏｓｅ Ｒｅｓｉｎ多糖树脂来纯化重组蛋白。 １．４ 斑马鱼ＳＡＡ蛋白的菌结合试验 将获得的斑马鱼ＳＡＡ纯化蛋白用于细菌结合试验，具体操作见文献［１０］。 １