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牛初乳中免疫球蛋白含量与生物活性物质的检测研究进展 摘要：牛初乳中免疫球蛋白含量与生物活性物质含量具有一定的正相关性，检测初乳中免疫球蛋白含量具有关联意义，通过检测牛初乳中免疫球蛋白含量，可以衡量牛初乳中生物活性物质的多少。免疫球蛋白具有独特的分子生物学结构和特性，常用的检测方法有琼脂免疫单（双）扩散、酶联免疫、高效液相色谱等方法，上述检测方法复杂，检测时间长且只限于实验室操作，所以建立一种适合于现场快速、操作简单的检测方法尤为重要。 1 项目研究背景、目的与意义初生犊牛的主动免疫系统尚未成熟，处在发育阶段，同时，由于牛胎盘结构的特殊性结构，母源性抗体难以通过胎盘屏障进入胎儿血液循环系统，导致犊牛出生前没有获得被动免疫能力免疫胶体金技术随着医学的发展而快速发展，免疫胶体金技术具有操作简单、快速出结果且结果易于判定、特异性好、不需要任何复杂的仪器、适用现场操作等特点，所以广泛地应用在兽医临床诊断中，本研究旨在建立免疫胶体金技术检测初乳中免疫球蛋白含量的快速测定方法，并在奶牛生产中推广应用。2 主要研究内容及预期目标2.1 主要研究内容2.1.1?兔抗牛免疫球蛋白抗血清的制备及抗体的纯化试验兔抗牛免疫球蛋白抗血清的制备包括兔的免疫及血清分离；抗体纯化包括DEAE-纤维素的活化、装柱、加样、洗脱和测定2.1.2?免疫胶体金技术检测初乳免疫球蛋白方法的推广应用将通过上述步骤建立的免疫胶体金测定初乳免疫球蛋白方法在奶牛场推广应用，进一步摸索应用条件和检测条件，并制定相关的技术标准。2.2 免疫胶体金检测牛初乳免疫球蛋白含量方法的建立2.2.1?胶体金颗粒制备采用柠檬酸三钠还原法??用超纯水把1%氯金酸溶液稀释100倍，浓度为0.01%，用微量移液器吸取0.01%氯金酸溶液50mL于三角瓶，置于电热板煮沸，准确量取一定量1%柠檬酸三钠溶液加入三角瓶中，轻轻摇匀继续煮沸，直至氯金酸溶液由蓝色变成红色，继续加热4min2.2.3?检测膜片的制备??用包被缓冲液把兔抗牛免疫球蛋白稀释成6种不同浓度，在每个硝酸纤维素膜片上选择6个不同的点，每个点滴10μL，室温阴干，在封闭液中封闭2h，再用PBS洗涤2次2.2.4?标准参照物的制备??将检测膜片分别与不同浓度的标准牛免疫球蛋白反应洗涤。取出用滤纸吸干，再与金标标准牛免疫球蛋白反应5min后洗涤2.2.5?样品的检测??将牛初乳样品离心，取中间层，将乳清适当稀释与检测膜片反应。取出膜片洗涤，再与金标蛋白反应，与标准参照物对比2.3 预期目标本研究采用免疫胶体金技术测定牛初乳免疫球蛋白，通过试验建立起免疫胶体金半定量检测牛初乳以及乳制品中免疫球蛋白含量的方法，实现现场、快速、简便易行的牛场初乳免疫球蛋白含量测定。3 研究方法、技术路线及实施方案3.1 兔抗牛lgG抗血清的制备及抗体的纯化3.1.1?兔抗牛免疫球蛋白抗血清的制备第一次免疫用弗氏完全佐剂抗原，在兔子皮下选没有重复的6个点进行注射，3周后进行第二次注射，选择弗氏不完全佐剂抗原注射，第4周进行第3次注射，7d后采兔子耳静脉血，测定血清效价，当效价达1∶16的效果，可以进行心脏采血，分离血清，-20℃冻存3.1.2?抗体纯化取1O?deae-纤维素浸泡在1000?mL蒸馏水中搅匀，静置、取细颗粒，用1000mL氢氧化钠溶液洗涤大约1h，再用蒸馏水冲洗至pH值接近7，做为缓冲液备用，采用重力沉降的原理装柱子，柱子选用直径2cm，长20cm的玻璃柱。血清用洗脱缓冲液透析，微孔膜过滤，4℃离心，加样，洗脱，测定获取的蛋白的纯度3.2??免疫胶体金技术检测初乳免疫球蛋白方法的推广应用将通过上述步骤建立的免疫胶体金测定初乳免疫球蛋白方法在奶牛场推广应用，进一步摸索应用条件和检测条件，并制定相关的技术标准。4 重点、难点和创新之处本研究将免疫胶体金技术引入定量测定牛初乳免疫球蛋白，通过试验建立起免疫胶体金半定量检测牛初乳及制品中免疫球蛋白含量的方法，实现适合牛场现场、快速、简便易行的牛场初乳免疫球蛋白含量测定。重点在于兔抗牛免疫球蛋白的制备和纯化、胶体金标记蛋白最适标记量和最适PH值的确定、检测膜片与金标蛋白最佳反应时间的确定等。5 实现本项目预期目标已具备的条件作者近年来主要从事动物性食品卫生检验的教学与研究工作，在奶牛营养代谢病的防治和犊牛健康保健技术方面做了较为广泛的研究，对奶牛营养，特别是犊牛饲养管理方面的营养管理方面积累了丰富的经验。项目的实施依托“现代农业产业体系北京市奶牛创新团队农职院综合试验站”和北京市奶牛产业科技资源站。近年来，项目团队已承担并完成多项项目研发与技术推广工作。以北京农职院为第一完成单位奶牛