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海南产守宫木安全性评价 sauropusandroginov（l）merr，sa），又名大戟科天青香、木冬、木条、越南、泰国枸杞、，在中国东南部和东南亚拥有悠久的食物历史。郭巨先等曾对小鼠的实验研究表明守宫木可能有一定蓄积毒性, 不适宜作为蔬菜长期日常食用, 这项研究结果的公布引起媒体、市民和商家的极大反响。其实早在1994年～1995年间, 台湾地区连续发生阻塞性细支气管炎的流行和爆发, 多项人群流行病学的研究证实病因可能与生吃一种减肥蔬菜——守宫木有关, 2005年日本学者也发表了类似病例报道。但至今关于守宫木引起阻塞性细支气管炎的病理机制仍然不明了, 动物实验研究的报道也是众说纷纭。为全面系统地评估守宫木的食用安全性, 本项目组采集我国海南产守宫木鲜样, 采取统一的前处理提取方法, 对其细胞毒性、遗传毒性、亚急性和亚慢性毒性、免疫毒性等进行系统研究和分析。本研究从小鼠脾淋巴细胞增殖能力、细胞因子分泌功能和腹腔巨噬细胞的吞噬功能的角度, 分析守宫木对免疫系统的影响和可能机制。 1 材料和方法 1.1 样品与饲料的制备 守宫木 (Sauropus androgynus(L) Merr, SA) 于早春二月采自海南省五指山县, 经华南师范大学生命科学学院高峰教授鉴定。守宫木嫩芽160 g, 加纯水240 ml低温研磨, 低温超声破碎, 过滤, 低温真空浓缩得50 ml提取液, 回收率为86.75%, 1 ml提取液相当于3.2 g守宫木鲜样, 0.22 μ滤膜除菌后, 用RPMI1640培养基分别稀释成25, 50, 100, 200, 400, 800和1 600 mg/ml浓度的受试样品备用。 SPF级BALB/C雌性小鼠, 6～8周龄, 体重18～22 g。由南方医科大学实验动物中心提供。合格证号:SCXK (粤) 2006-0015, 质量合格证编号:0040118。颗粒饲料由南方医科大学实验动物中心提供。动物实验室:SPF级, 使用许可证号:SYXK (粤) 2003-0011, 室温 (22±2) ℃;湿度50%～75%。 小鼠Th1/Th2 (IL-2, IL-4, IL-5, TNF, IFN-γ) CBA试剂盒 (Cat:551287) 和流式细胞仪 (FACS Calibur) 为美国Becton Dickinson公司产品;CASY DT型快速细胞分析仪为德国SCH?RFE SYSTEM公司产品;RPMI1640培养液为美国GIBCO 公司产品 (Cat:C22400) ;伴刀豆球蛋白A (ConA) 为美国Worthington Biochemical公司产品 (Cat:50K904J) ;脂多糖 (LPS) 为美国Sigma公司产品。 1.2 th1/th2的诱导诱导表达 无菌取10只小鼠脾分别制备成单细胞悬液, 用CASY DT型快速细胞分析仪计数活淋巴细胞数, 调整细胞浓度为6×106/ml, 然后将各细胞悬液分至2块96孔培养板中, 其中一板进行ConA诱导的T淋巴细胞增殖反应, 另一板进行LPS诱导的B淋巴细胞增殖反应, 守宫木提取物终浓度分别为10、20、40、80、160和320 mg/ml, ConA和LPS终浓度分别为5和1 μg/ml, 置体积分数为5%的CO2, 37 ℃培养72 h后, 收集ConA诱导的T淋巴细胞增殖反应孔培养上清, 755 g 4 ℃离心5 min后取上清, 使培养上清中所含Th1/Th2细胞因子浓度进入标准曲线浓度范围。取连续倍比稀释的标准品和待测样品, 按照CBA试剂盒说明书完成样品孵育步骤并对流式细胞仪进行设置, 然后用流式细胞仪和CBA分析软件获取数据并分析。 1.3 小鼠细胞中的小球物理细胞的制备 参照本实验室所建立的流式细胞术检测小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的方法, 小鼠腹腔巨噬细胞收集及荧光微球前处理方法见文献, 收集6只BALB/C小鼠腹腔巨噬细胞各2 ml, 细胞浓度为4～6×105/ml, 分至8孔, 与调理后的荧光微球分别与终浓度为0、5、10、20、40、80、160和320 mg/ml的守宫木提取物37 ℃避光孵育2 h, 冷PBS洗涤1次后, 70 μm过滤器过滤后上流式细胞仪分析吞噬比例 (PP) 和吞噬指数 (PI) 。 1.4 数据分析和相关性分析 实验数据经SPSS 10.0统计软件包处理并分别进行非参数Mann-Whitney检验 (淋巴细胞增殖功能和细胞因子含量比较) 、单因素LSD方差分析 (巨噬细胞吞噬功能比较) 和Pearson相关性检验 (相关性分析) 。 2 结果 2.1 组小鼠红细胞增殖能力 小鼠脾淋巴细胞在体外与守宫木提取物和ConA或LPS共培养72 h后, 10～320 mg/ml剂量组淋巴细胞增殖能力均