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腺病毒载体研究进展 20世纪80年代末，基因治疗作为一种新兴的医疗手段出现了。1990年, 第一个基因治疗方案在美国被批准进入临床观察。到目前为止, 在全世界范围内已有上千个基因治疗方案进入临床观察。基因治疗特别是在疑难疾病的治疗方面显示出巨大的应用潜力, 为人类疾病治疗开辟了一条新的途径。 目前的基因治疗载体主要分为病毒载体和非病毒载体。非病毒载体安全但低效, 病毒载体经过改造后保留对机体细胞的感染能力, 但不具有致病性, 使用相对安全, 且感染效率高。应用较多的病毒载体有反转录病毒 (包括HIV) 载体、腺病毒载体、腺病毒相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体和甲病毒载体等。 由于腺病毒载体具有许多独特的优点, 是目前应用最为广泛的一种病毒载体。本文就腺病毒载体的研究进展作一综述。 1. 苏氏原螯虾traft 腺病毒是一种线性无包膜的双链DNA病毒, 病毒颗粒直径约60~90 nm, 呈20面体立体对称。病毒衣壳有252个壳粒, 规则排列成 240个六邻体 (Hexon, 每面12个) 和12个五邻体 (Penton) 单位, 其中五邻体位于顶角处, 从每个顶角壳粒的基底伸出一根纤毛突起 (Fiber protruding) , 其末端具有一个结节区 (Knob domain) 。因此腺病毒的衣壳结构可以分为五邻体和六邻体两部分, 其中五邻体又由五邻体基底部 (Penton base) 、纤毛突起和结节区组成。 腺病毒的基因组约为36 000 bp, 基因组两端各有长100~150 bp的末端反向重复序列 (Inverted terminal repeats sequence, ITRs) , 在其左端ITRs 3′端为长约300 bp的包装信号 (Ψ) , 它们是腺病毒复制包装所必需的顺式作用元件。根据病毒 DNA复制前后顺序, 可将基因分为早期和后期转录单元, 早期基因可分为E1a、E1b、E2a、E2b、E3和E4, 编码病毒的调节蛋白;后期基因由L1~L5组成, 编码病毒的结构蛋白。 野生型腺病毒可感染人体多种组织细胞, 并在细胞内复制, 产生大量子代病毒。目前用于基因治疗的多为人类的2型和5 型腺病毒, 其感染细胞的过程是从纤毛的结节区黏附到细胞表面的与柯萨奇B病毒共用的一种受体——柯萨奇/腺病毒受体 (Coxsackie adenovirus receptor, CAR) 开始的。随后病毒五邻体基底部的精-甘-天门冬氨酸三肽 (RGD) 与细胞表面的αυβ3和αυβ5整合素结合, 通过内吞作用将腺病毒内化到细胞中。进入细胞后, 外包装壳蛋白解体, 使病毒粒子进入细胞质, 然后转位到细胞核, 通过核孔将病毒DNA释放到细胞核内。病毒基因组进入细胞核后, 再经过一系列剪切和转录过程, 最终包装成新的病毒颗粒。 2. 病毒防护装备的分类 现有的腺病毒载体可根据病毒基因的置换程度, 分为第一、第二和第三代。 2.1 第二,5型腺病毒可组成性诱导的实际细胞的复制 第一代腺病毒载体是由去除腺病毒基因组的E1和/或E3两个区而获得的。E1基因为病毒复制必需区, 其缺失使腺病毒载体成为复制缺陷型。E3基因是病毒复制非必需区, 可用作外源基因插入区。由于E1基因的缺失, 造成病毒复制的缺陷, 使其复制必须在由5型腺病毒转化的可组成性表达E1蛋白的293细胞中完成。 第一代腺病毒载体宿主范围广, 感染率高, 容易制备高滴度病毒, 稳定、高效率转导目的基因, 致病性低, 不整合入细胞基因组, 不但可以转染分裂期细胞, 而且可以转染静止期细胞, 但也存在许多不足之处:①载体的包装容量有限, 最多仅能转导8 000 bp的外源基因片段;②外源基因表达时间短, 表达水平低;③免疫原性强, 使重复感染失效;④病毒载体与表达E1蛋白的293细胞之间存在同源序列, 通过重组, 可重新获得E1区, 出现复制型腺病毒。 2.2 第二代载体el蛋白 基于第一代腺病毒载体的以上缺点, 人们对其进行了不断的改进, 进一步去除病毒基因, 提高载体容量, 减弱病毒蛋白所致的细胞免疫反应。 1994年, Engelhardt等将E1区缺失的病毒E2a基因发生点突变, 构建一个含lacZ的重组载体, 使E2a基因产物DBP (DNA结合蛋白) 具有温度敏感性, 在40.5℃时可阻断晚期基因表达, 使病毒不能复制。动物实验表明这种载体引起宿主炎症反应的作用比早期载体弱, 导入标志基因产物 (β-半乳糖苷酶) 表达时间略有延长。 进一步改建的第二代载体, 使病毒基因组产生了更多的缺失, 使载体的装载能力更大, 允许插入最大约14 000 bp的外源序列, 并进一步降低了病毒蛋白的表达。引起的宿主抗病毒免疫反应与第一代载体相比要弱很多, 细胞毒性也有所减弱。同时, 为了避免