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药物代谢组学的研究进展 代谢组学是20世纪90年代末快速发展起来的一门新兴的组学学科。这是系统生物学研究的重要组成部分。主要通过组织指导指数的分析，定量研究生物体的内部和外部因素（例如遗传因素、疾病入侵、药物干预、环境变化等）。在一般意义上，mw-1000是品种和数量变化的动态规律，以及与生理和病理改变之间的关系。代谢组学以生物体内参与物质传递、能量代谢和信息传导等代谢调控的全体小分子物质即代谢组(metabolome)为研究对象,这些内源性小分子代谢物处于生物信息流的末端,它们的整体轮廓包含着基因组(genome)、转录组(transcriptome)、蛋白质组(proteome)变化及相互间协调作用的终极信息,能直接反映生物体的表型(phenotype)特征。 代谢组学是在问题导向和应用驱动下,现代分析技术与化学计量学、生物信息学技术融合促生的产物,随着主要技术瓶颈被相继攻克,代谢组学目前正进入快速发展期。1999~2012年13年间基于代谢组学研究的论文被SCI收录数和国家自然科学基金资助的科研项目数均呈现指数增长趋势(图1)。代谢组学已成为医学和生命科学领域的一新兴前沿研究热点,并在疾病诊断与预后、环境毒理学、食品营养科学、植物学等研究方向取得了突破性进展,展现出较强的科学潜能。代谢组学与药学的紧密交叉、有机结合更是促生了药物代谢组学(pharmacometabolomics)这一重要分支,它通过比较分析给药前后个体的代谢表型(metabolic phenotype)和反应表型(drug-reaction phenotype)来进行药物疗效或毒性评价、预测。本文在笔者所在课题组多年研究基础上,对药物代谢组学研究的流程、技术要点和应用等方面的最新进展进行介绍。 1 药物代谢研究的过程和技术要点 完整的药物代谢组学研究流程包括生物样品采集、生物样品制备、数据采集、数据处理与分析等步骤(图2)。 1.1 样本采集和分类 药物代谢组学的研究对象按来源不同,可分为动物样本(尿、血清、血浆、组织、器官、唾液、肺泡冲洗液、脑脊液等)和人体样本(尿、血清、血浆、唾液、眼泪、头发等)。在选取生物样本种类时,既需充分考虑实验的目的、分析仪器的特点,同时要兼顾实验动物和人体试验伦理学。 血样和尿样由于易于采集且蕴含代表生物体整体特征的代谢物信息,是目前最常采用的样本类型。又由于两者所含代谢物在种类上各有偏重,具有互补性,因此多数情况下血液和尿液样本会被同时采集。需要特别提醒的两点是,由于采用了抗凝剂,在选取血浆时需考察所选用的抗凝剂是否会对小分子代谢物有影响;尿样虽然具有非侵害性(non-invasive)的优点,但却也存在影响因素多、个体差异性大的缺点,一般需要通过加大样本数量的方法来弥补。 一般液体生物样本(尿、血样、唾液)的采集量为毫升级,固体生物样本(组织、器官)的采集量为毫克级,细胞培养样品按细胞数计为1×106~1×107级。为确保样品的代表性,减少生物样本个体差异对结果的影响,需要采集足够数量的样本,同时要注意组间性别、体重、年龄、种族、饮食习惯、采集时间、取样部位的匹配问题。 由于生物样品易受残留酶、氧化还原反应等的影响,生物样品在采集后需立即进行灭活处理即“淬灭”,最常用的方法是冷冻处理(液氮、-80℃冻存)、冷冻干燥、冷甲醇(-40℃)处理等,应尽量避免采用强酸、强碱、高温等易引起代谢物降解的灭活方法。 1.2 样本检测方法 生物样品预处理与制备的目的是将待测物从复杂生物基质中提取出来,去除干扰杂质,转化为适合测定的物质形式,以提高灵敏度和选择性。目前代谢组学研究中生物样品的提取方法主要包括液液萃取、冷冻干燥、加速溶剂萃取、超声波萃取、固相萃取、固相微萃取等,其中以预冷(-20℃或4℃)甲醇、甲醇-氯仿(3∶1)液液萃取最为常用。处理组织样本时,冷冻干燥法具有定量可控、操作简便的优点,使用较多。由于尿液中尿素含量很高,其宽大GC/MS色谱峰往往容易掩盖相邻小的代谢物信息,因此多数情况下需采用尿素酶消解的方式处理。 最大程度的保留和体现代谢物信息,减少干扰信息(降解、干扰物引入)的产生是选取生物样本制备方法的核心原则。依据实验目的、生物样本种类和数据采集所用分析仪器的不同,所采取的样本提取制备步骤也有所差别。例如,采用核磁共振(NMR)为数据采集手段时,对样本制备要求相对简单,样品一般只需要加入缓冲盐溶液调节p H,以减少酸碱度变化造成的化学位移偏差;若以气质联用(GC-MS)技术采集数据,样本在进样前需要做复杂的衍生化处理,最常用的是甲氧基胺肟化结合MSTFA硅烷化的两步衍生化法,以降低待测物的沸点、提高稳定性、增强质谱响应、调节色谱行为;液质联用(LC-MS)分析前,样本一般会加入有机试剂或过滤膜以除去大分子蛋白。