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代谢组学的研究与应用 代谢组学是研究生物内源性代谢物质的类型、数量和内外因素的学科。这是系统生物学的重要组成部分。20世纪90年代末, Nicholson首次提出“metabonomics”概念, 它的含义是“定量测定生物系统对病理生理刺激以及基因改变产生的多参数代谢的动态应答”。随后, Fiehn又首次提出“metabolomics”概念, 将代谢组学定义为定性定量测定特定限定条件下生物样品中的总体代谢谱。随着这项学科研究的发展, 现在科学家们认为代谢组学 (metabonomics/metabolomics) 是对某一生物或细胞内所有低分子质量 (MW1 000) 的代谢物质进行定性和定量分析, 将在内外因素作用下产生的代谢物质的动态变化与病理生理相关联。 代谢组学的研究对象是生物体内小分子代谢物总和的代谢组, 它们是基因表达和代谢产生的中间产物或最终产物。代谢组学处于生命信息传递的终端, 它能表现出生物体系整体功能或状态的最终结果, 并且与基因组学、转录组学和蛋白质组学共同构成系统生物学整体。代谢组学具有代谢物种类远小于基因蛋白的种类数、代谢物易被检测、各个生物体系研究手段与技术通用等优点。随着分析技术的不断发展完善和数据处理方法的不断优化创新, 代谢组学的研究范围涉及微生物学、植物学、食品及营养科学、毒理学研究、临床疾病诊断、药物开发等诸多研究领域。本文将对代谢组学研究的流程及其相关的分析技术的进展进行介绍。 1 代谢组研究流程 代谢组学研究流程一般包括生物样品的采集, 样品预处理, 数据的采集、分析和解释等。分析技术和数据处理方法构成其主要研究平台。 1.1 样本的采集和处理 代谢组学的研究对象通常是生物样本, 一般有生物体液 (如血液、尿液、唾液和脑脊液等) 、细胞提取物、细胞培养液、组织提取液以及粪便等。实验设计中应充分考虑样品收集的种类、部位、时间、样本群体等因素。在研究人类样本时, 还需要考虑组间性别、种族、年龄、体重、饮食习惯和地域等因素。在处理生物样本时要避免样本受残留酶活性或氧化还原反应等的影响。一般需要对所收集的样品进行快速猝灭, 如采集之后立即进行液氮冷冻、酸处理等。 1.2 预处理方法的选择 生物样品预处理应该根据不同的化合物选择不同的提取方法, 并对提取条件进行优化, 除去干扰杂质, 将样品转化为适合测定的物质形式, 以提高仪器检测时的灵敏度和选择性。常用的预处理方法有固相萃取、固相微萃取、亲和色谱等。代谢组学研究在提取和预处理样品的操作过程中, 应尽可能保留和体现样品中代谢物组分的完整信息。 1.3 代谢组学研究 目前代谢组学研究中数据采集最常用的分析技术包括核磁共振 (NMR) 、气质联用 (GC-MS) 和液质联用 (LC-MS) , 并且多种分析技术联用进行代谢组学研究已成为当今的研究趋势。 1.4 生物代谢的关键环节 代谢组学数据信息处理与分析是代谢组学研究的关键环节, 其一般包括数据预处理、模式识别与模型评价、生物标记物筛选与鉴定、代谢物生物功能解释和代谢通路分析等步骤。 1.4.1 色谱-质谱联用技术的实现过程 原始数据需要经过预处理, 以保留与分类有关的信息, 消除实验过程和分析过程中多余干扰因素的影响。不同分析技术有各自不同的数据预处理方式。色谱-质谱联用技术的原始数据信息主要是离子的保留时间、质核比和峰面积, 这些原始数据需要经过归一化、标度化、滤噪和色谱峰对齐等步骤。这些操作可采用XCMS、Markerlynx等软件完成。针对NMR数据的预处理主要包括消除噪声和谱峰化学位移漂移、分段积分、归一化、标度化等步骤, 用于预处理NMR数据的软件主要有Mestre Nova、Xwin NMR、Automics和MDAS等。 1.4.3 结构鉴定和数据库构建 医药学研究中代谢组学常常需要对疾病发病机制或药物治疗相关的代谢标志物进行研究, 常用的分析方法有PCA等模式识别方法、t检验和方差分析等。以上多元统计分析和单变量统计分析相结合, 可以提高筛选差异变量的准确性和可信度。筛选出的差异变量需要经过结构鉴定, 代谢物数据库提高了代谢物鉴定效率, 但是目前代谢组学研究尚无功能完备的数据库。对LC-MS分析获得的生物标志物的定性方法还主要依靠与标准品的比对来判定;NMR和GC-MS分析需要经过各自相关的数据库匹配, 如Chenomx NMR Suite、NIST、Fiehn GC-MS Database;现阶段, 对以上分析手段也常用一些生化数据库或者相关的文献报道进行未知代谢物的结构鉴定。 1.4.4 与基因组教学信息相关的疾病资料 一些生化数据库可以用于已知代谢物的生物功能解释, 如京都基因与基因组百科全书 (KEGG) 、METLIN、人体代谢组数据库 (HMDB) 等。通过Met