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虫草菌丝体对实验性慢性肝炎纤维化形成的抑制作用 慢性肝炎在我国发病率很高，发病率年龄很小，疾病隐蔽，病史延迟。病人常在30～40 a即进展为不可逆转的肝硬化,并发上消化道出血、肝性脑病、顽固性腹水,反复发作,严重影响病人的生存质量,危害病人的生命安全。肝纤维化是慢性肝炎向肝硬化发展的必经途径,具有持续时间长、可逆转的特点。如能得到有效治疗,则可防止或延缓慢性肝炎向肝硬化的发展。因而肝纤维化防治具有极其重要的临床意义。我国传统的中医药在肝纤维化的防治领域具有独特的优势。已有一些中药为临床和实验研究证实有抗纤维化的作用。其中虫草菌丝是受到广泛关注的一种。但其确切的作用机制尚不完全清楚。本研究复制了慢性肝炎→肝纤维化→肝硬化的动物模型,并给予虫草菌丝干预,以观察其对这一病变过程的阻断作用。同时我们在蛋白和mRNA水平设置了一系列指标,旨在深入探讨其作用机制,为延缓或预防慢性肝病向肝纤维化、肝硬化发展的临床治疗提供理论依据。 免试剂盒和检测试剂 材料Wistar大鼠37只,雌雄各半,体重(275±s25)g,购自重庆医科大学实验动物中心。透明质酸(HA)、板层素(LN)放免试剂盒由上海海军医学研究所提供。血小板衍生生长因子 (PDGP)mRNA,转化生长因子β1(TGFβ1)mRNA,Ⅰ型和Ⅲ型前胶原mRNA原位杂交检测试剂盒购自武汉博士德生物工程公司。抗TGFβ1单克隆抗体,抗PDGF单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司。抗α-平滑肌动蛋白(α-SMA)单克隆抗体由福州迈新公司提供。虫草菌丝由保定制药厂提供。CCl4及无水乙醇购自本校设备科。 方法 1 模型大鼠的分组及处理 Wistar大鼠37只,体重(275±s25) g,分为3组,其中模型对照组(模型组)20只,虫草菌丝组(虫草组)10只。(根据预实验结果,模型对照组有较高的死亡率,因而预先分配较多的样本量)。另设正常对照组7只。将CCl4及色拉油混合制成40%溶液,给予模型组及虫草组大鼠皮下注射,首次剂量为0.5 mL·100 g-1体重,以后为0.3 mL·100 g-1体重,每周2次,同时给予5%乙醇作为唯一饮料自由饮用,对照组给予0.5 mol·L-1磷酸缓冲液(PBS)0.3 mL·100 g-1体重,皮下注射并自由饮水,实验开始10 d后,模型组随机处死2只大鼠,取肝组织作石蜡切片HE染色观察病理学变化。虫草组同时给予33%虫草菌丝生理盐水悬浊液1.5 mL·100 g-1体重(折合虫草菌丝0.5 g·100 g-1体重)每日灌胃,其余模型组及正常对照组大鼠给予生理盐水1.5 mL·100 g-1每日灌胃。给药过程持续9 wk。整个实验过程中,模型组死亡12只(其中2只为随机处死),存活8只。虫草组死亡4只,存活6只。正常对照组大鼠无死亡。9 wk末处死全部存活大鼠。 2 肝组织病理学检测 以0.5%异戊巴比妥钠0.4 mL·100g-1体重,腹腔注射,待动物麻醉后,体外心脏采血5 mL,血细胞自然沉降后,取血清1～2 mL,4 ℃冰箱保存待检。打开腹腔,取肝右叶,切取肝组织1 cm×1 cm×3 mm,置于含0.1 %焦碳酸二乙酯(DEPC)的4 %多聚甲醛0.1 mol·L-1PBS固定液中固定。24 h内石蜡包埋、切片。使用EX7全自动生化测定仪测定血清ALT,AST含量。使用放免法检测血清HA,LN含量,操作步骤参照试剂盒说明。常规HE染色观察肝组织形态。免疫组织化学检测采用S-P法。使用试剂盒中自带片为阳性对照。以0.5 mol·L-1PBS代替第一抗体作为空白对照。 3 抗兔igg的制备 切片经二甲苯脱蜡,用梯度酒精及蒸馏水清洗。滴加H2O2,室温下搁置10 min。滴加胃蛋白酶,37 ℃温育15 min,0.5 mol·L-1PBS洗涤5 min×3次,蒸馏水洗涤1次。滴加原位杂交预杂交液,37 ℃温育2 h。滴加杂交液(含探针),37 °C温育过夜。次日,滴加5 %非免疫牛血清封闭液,37 ℃温育50 min。分别滴加抗地高辛兔IgG及生物素化山羊抗兔IgG,37 ℃各温育20 min。滴加链霉亲和素-过氧化物酶复合物,37 ℃温育20 min,0.5 mol·L-1PBS洗涤5 min×4次。滴加显色剂,苏木精复染,酸酒精分色,水洗,烘干。二甲苯透明,中性树胶封片,以预杂交液取代探针作为空白对照。 4 肝脏显色指数法 α-SMA染色结果使用Gorch评定法,即设空白对照为(-),阳性对照为(++),介于两者之间为(+)。其余各项免疫组化及原位杂交染色结果换算为显色指数,方法参照文献。具体为:按显色程度分弱、中、强3种,分别用+,++和+++表示。按显色范围分为:+为显色范围占肝脏1/4;++为显色范围占肝脏1/4～2/4;+++为显色范围