补阳还五汤联合神经干细胞对脊髓损伤大鼠运动功能恢复的影响.docxVIP

补阳还五汤联合神经干细胞对脊髓损伤大鼠运动功能恢复的影响 目前，脊柱损伤的治疗仍然是一个全球问题。神经干移植的研究为解决这个问题提供了机会，并在动物实验中取得了良好的效果，为临床应用提供了广阔的前景。补阳还五汤为清代名医王清任所创, 始载于《医林改错》, 具有补气活血、通经活络作用。经长期实践检验, 被肯定为经典治瘫良方。为此,本研究联合应用补阳还五汤与神经干细胞移植,为临床脊髓损伤探索新的治疗策略。 1 实验数据 1.1 手术模型的分组 成年SD大鼠40只,体质量180～220 g,雌雄各半(本校实验动物中心提供),脊髓段全横断损伤造模成功后分为4组:补阳还五汤+神经干细胞移植组(中药干细胞组)、补阳还五汤组(中药组)、神经干细胞移植组(干细胞组)和不治疗组(对照组)。每组10只,术后8周后进行行为学和电生理检测并观察脊髓组织结构变化情况。 1.2 不同途径填充明胶海绵 动物腹腔内注射戊巴比妥钠进行麻醉,在无菌条件下切开皮肤,分离肌肉,切除T8和T9脊柱椎板暴露脊髓,在T10脊髓段做全横断。随后在横断处填入约2 mm×2 mm×2 mm的明胶海绵。其中中药神经干细胞组和神经干细胞组的明胶海绵内含有10 μL神经干细胞,中药组和对照组的明胶海绵内含有10 μL DMEM培养液。逐层缝合肌肉和皮肤。术后每只动物每天肌肉注射青霉素10万IU,连续3 d,人工排尿。 1.3 中药+nscs对大鼠造模后生长和身身健康的影响 中药组大鼠造模后当天即开始每天1次中药灌胃,生药浓度为0.6 g/mL,按0.5 mL/100 g的剂量灌胃,即3 g/(kg·d);中药+NSCs 组大鼠造模后随即移植NSCs,并于动物苏醒后开始每天1次中药灌胃,剂量同中药组。4周为1个疗程。对照组每天给予等体积蒸馏水灌胃。 1.4 scs传代鉴定 从E12孕鼠胚胎中分离胚胎脊髓组织,经400目筛网过滤制成单细胞悬液后在NSCs完全培养液中培养,直至的神经球形成,传代进行Nestin免疫细胞化学鉴定。取第2代培养7～8 d的神经干细胞,经细胞计数后制备浓度为5×1012L-1的神经干细胞悬液,抽取10 μL细胞悬液注入脊髓横断处的明胶海绵内。 1.5 术后动物的能力恢复观察 对4组动物进行日常行为学的拍摄录像。将大鼠置于一个直径150 cm×60 cm的椭圆形运动区域中。BBB分级评分法根据脊髓损伤后动物后肢的运动能力分为21个等级,即最高分为21分。采用爬网格测试方法,对术后4组动物进行爬网格训练(45°斜坡),观察其后肢运动的恢复情况。评分取双后肢评分的均值。 1.6 皮质诱发电位测试 各组大鼠于8周时进行电生理测试。麻醉动物,将大鼠固定于脑立体定位仪上,暴露双侧坐骨神经。参照大鼠脑立体定位图谱,在对应双侧皮质躯体感觉运动区的部位打开颅骨,剥去表面脑膜,暴露大脑皮质。将1根电极与坐骨神经接触,另1根电极与大脑皮质表面接触。另外,参考电极插入头皮下,地线插入鼠尾。所有电极接在Biolap2410智能型生物信号显示与处理仪上。测试时坐骨神经上的电极接记录端口,大脑皮质上的电极接刺激电源,记录皮质运动诱发电位(CMEP)。记录完一侧的诱发电位后按同样方法检测另一侧坐骨神经与躯体感觉运动区皮质之间的诱发电位。测量所有大鼠的CMEP潜伏期和峰峰值,每只大鼠记录3次,进行统计学分析。 1.7 统计处理 采用SPSS 11.5统计软件处理数据,结果用均数±标准差表示,各组间的差别采用单因素方差分析进行比较,P0.05为显著性差异。 2 结果 2.1 神经球及其免疫细胞化学检测 大鼠胚胎脊髓源性NSCs呈细胞克隆生长,1个月后细胞克隆增大形成神经球,直径约150 μm,略小于脑源性神经干细胞球,免疫细胞化学结果示细胞球呈Nestin免疫阳性反应,在神经元培养液中培养1周时,免疫细胞化学结果示细胞呈Tubulin免疫阳性反应。见图1。 2.2 术后运动情况 大鼠经T10脊髓段全横断手术后,其后肢随即完全瘫痪,在地面或斜坡网格爬行时,双后肢通常被拖在身体的后方,没有观察到后肢关节活动,按BBB法评分为0分。8周时各组大鼠在连续2 min地面爬行过程中,后肢均显示不同程度的关节和肌肉运动。依BBB评分测评,中药干细胞组评分优于中药组和干细胞组,中药组和干细胞组评分均高于对照组,均有显著性差异(P均0.05)。术后8周时,每组受试动物在5 min内后肢爬行45°斜面的网格坡道,并攀上平台。对照组大鼠后肢运动很少,主要依靠前肢拖行,该组有2只攀上平台。其他3组大鼠均能不同程度地利用后肢运动攀爬,有些还能用后肢支撑爬行。干细胞组有5只攀上平台,中药组有4只攀上平台,中药干细胞组有7只攀上平台。见表1。 2.3 髓内循环波场和主反应波形 正常大鼠CMEP的主反应呈先正后负的PN型波。当