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血友病a患者及家系中基因倒位的间接诊断 血友病（ha）是对患者的健康和生命威胁最大的遗传因素之一。其遗传规律为X连锁隐性遗传。目前对本病尚无有效根治方法,因此开展基因诊断、携带者检出,以及产前基因诊断,是防止新的患儿出生、阻断有害基因传递的有效措施。但FⅧ基因相当大,由26个外显子和25个内含子组成,全长达186 kb。已知HA中的一半为重型,而重型HA中,约有40%～50%是由于发生在FⅧ基因22内含子中的倒位所致。已有报道用长距离PCR(LD-PCR)技术可以快捷、灵敏地查出这种基因倒位,这样约四分之一的家系可直接用此技术作出基因诊断、携带者检出及产前诊断。除此之外导致约70%～80%的血友病A的Ⅷ因子(FⅧ)基因突变呈高度异质性,因此完全靠直接查找其基因突变的直接诊断方法,工作量很大、时间长。我们运用3项以PCR技术为基础的基因连锁分析方法进行间接诊断,以期为所有的HA家系成员都能作出基因诊断。本文报道运用上述方法查出7例FⅧ基因倒位,并完成19个非倒位HA家系基因诊断的结果。 对象和方法 一、 病例选择选择源于省域 26例HA患者及数目不等的家系成员分别来自北京、天津、江苏、湖北、四川、山东、广西、广东、福建等地,均经省市级以上医院确诊。患者均为男性,年龄从1岁至73岁不等。家系成员中有患者的姐妹、兄弟、妻子、女儿、外孙女等。每人取3～5 ml静脉血,乙二胺四乙酸或酸性柠檬酸葡萄糖溶液B抗凝,盐析法抽提基因组DNA,部分采用酚/氯仿法抽提。 二、 方法 1. ycartgradint983/损害赔偿/双循环扩增ycarli1 在0.2 ml薄壁反应管内,按文献的方法加入PCR混合物,于梯度PCR仪(Robocycler Gradient96)上进行扩增,循环条件为:94℃ 12 s,65 ℃15 min,共30个循环,在后20个循环中,每一循环的65℃延伸时间延长20 s。扩增后进行1×TBE配制的0.6%琼脂糖凝胶电泳,EB染色后用凝胶呈像仪观察,分析结果。 2. pcr扩增条件 用于BclⅠ多态性分析的引物根据FⅧ 外显子18和内含子18基因序列自行设计:P1: 5′ TTC ATT TCA GTG GAC ATG TG 3′,P2: 5′ CCT ATG GGA TTT GAG ATG GT 3′。扩增片段长度为374 bp,含有BclⅠ酶切位点的片段经BclⅠ酶切后长度为211 bp和163 bp,不含BclⅠ酶切位点的片段经BclⅠ酶切后长度仍为374 bp。在25 μl体系中,含基因组DNA 0.1 μg,引物P1和P2 各0.4 μmol/L,dNTP 100 μmol/L,1×buffer,Taq DNA聚合酶0.5 U。按以下条件进行扩增:预变性94℃2 min,94℃ 40 s,60℃ 40 s, 72℃ 40 s,30个循环后,72℃延伸5 min。取PCR产物5 μl进行2%琼脂糖凝胶电泳,观察到DNA扩增的特异片段后,取PCR产物5 μl,用BclⅠ酶10 U,50℃保温4 h,酶解产物进行2%琼脂糖凝胶电泳,确定酶切位点的有无,进行连锁分析。 3. 引物和扩增方法参考 以家系各成员的基因组DNA 0.1 μg为模板,所用引物和扩增方法参考文献。取PCR产物5 μl进行0.8%琼脂糖凝胶电泳,EB染色后用凝胶呈像仪观察扩增片段,进行连锁分析。 4. 显色条带的制备 参照Lalloz法,但我们没有采用放射性标记法,而是用银染法和EB染色法。银染的主要步骤为:电泳结束后,将凝胶浸入固定液(10%乙醇、0.5%乙酸)中置摇床上慢速摇动15 min,弃去固定液,换染色液(0.2%硝酸银)置摇床上染色10 min,弃染色液,以蒸馏水漂洗两次,每次1 min,然后加入显色液(1.5%氢氧化钠、0.4%甲醛)显色至条带清晰,及时终止显色。EB染色同常规操作。用凝胶成像仪照相或干胶保存。 公正诊断家系 1. 16个重型血友病A家系FⅧ基因倒位的检测:在16个重型血友病A患者中查出7个具有FⅧ基因倒位,占43.8%。其中14个DNA标本LD-PCR产物电泳分析的图谱中,标本1、2、3、7、8、10、11、14只出现12 kb带,为野生型,即非基因倒位;标本4、9、12只出现一条11 kb带,这说明这3位男性患者的FⅧ基因有倒位;标本5、6、13有11 kb、12 kb两条带,此3例是该基因倒位的女性携带者(图1)。 2.用BclⅠPCR/RFLP法对 19个非倒位HA家系基因进行分析的结果:家系8先证者基因型为374/-,其母为374/211,由遗传规律可知先证者母亲的374 bp片段与HA致病基因连锁。先证者之大姐基因型为374/211,其374 bp来自母亲的致病性FⅧ基因连锁片段,故诊断其大姐为携带者。