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影响纤维素酶酶活测定因素的研究 纤维素酶是一种多组酶，其组成与其他酶类似。同时，当它用于特定物质时，它会形成多个最终产物和各种反馈控制机制。再者该酶的作用底物, 是结构不均匀且其性质也各不相同的物质, 这又导致其被酶解的感受性会有所不同。目前虽然国内外已有人提出了一些纤维素酶活力测定的方法, 但因应用面的不同, 所采用的作用底物以及测定方法中各项条件都不统一, 这会对酶活力的最终测定结果有所干扰, 以致难以作出比较。本文就纤维素酶活力测定中有关的几个主要影响因素作一比较, 以供制定统一方法时参考。 1 %1%甲基纤维素钠缓冲液dm (1) 0.05 mol/L, pH4.8醋酸-醋酸钠缓冲液; (2) 3, 5-二硝基水杨酸溶液 (DNS) ; (3) 0.5%～1%羰甲基纤维素钠溶液 (CMC) ; (4) 葡萄糖标准溶液; (5) 纤维素酶样品。 2 方法 采用CMC为底物, DNS法测定还原糖的生成量。 3 影响纤维素酶cmc酶活力测定的因素 3.1 不同试剂对测定结果的影响 选用几种来源不同的CMC, 由于其粘度性质的差异, 影响了测定的结果 (见表1) , 其中600～1 200 mPa·s型进口分装试剂测定结果比其它试剂约高30%。 3.2 底物浓度对测定结果的影响 采用相同的测定方法, 改变底物的浓度, 使其分别为1%、0.7%、0.5%。从表2结果可见, 底物浓度对测定结果有较大影响, CMC浓度愈高, 测定结果也愈高。1%浓度比0.5%浓度约高50%。 3.3 万倍至3万倍 采用相同的测定方法, 改变酶样品的稀释度, 使之从0.05万倍至3万倍。从表3结果可见, 稀释度的改变, 明显影响酶活力测定结果, 稀释度大, 结果偏高;稀释度低, 结果偏低。因此, 测定时, 应规定合理的OD值范围。 3.1 不同浓度反应时间 采用相同的测定方法, 改变反应时间, 使其分别为10、20、30 min, 在表4a中, 当酶液浓度相同而ΔOD0.25～0.6时, 反应时间短的其酶活力较高。在表4b中, 当酶浓度不同而ΔOD0.25～0.26时, 改变稀释浓度, 使产生葡萄糖量相同时, 酶活力基本一致。 3.5 5, 采用相同的测定方法, 只改变反应温度, 使之在40～65℃变化, 结果如表5。由表5可见反应温度高, 酶活力高 (目前规定温度多为50℃) 。 3.6 ds用量对l 采用相同的测定方法, 改变DNS用量1～3 mL, 由于DNS用量变化,OD值相当的葡萄糖量也有不同, 根据相应的标准曲线常数计算, 结果如表6, 随着DNS的加量增加, 酶活力值减少。 43 不同的、、和od值对提取的影响 A、B、C 3个方法是目前有关单位采用的纤维素酶 (CMC酶) 分析方法, 由于其中⑴、⑹、⑺和ΔOD值的要求等有不同, 会导致测定的综合结果相差很大, 以反应产生0.5mg葡萄糖时的ΔOD值计算酶活力, A比B高46%, B比C高19.3%, B法中, 由于设置的ΔOD值及第⑼项与第⑽项相差悬殊, 酶活力 (a) 大于 (b) 一倍多。 5 酶活力测定方法的确定 ⑴从表1至表6可见, 纤维素酶活力的测定结果会受多种因素的影响, 尤以底物浓度、反应温度、稀释倍数影响最大。DNS用量、底物性质、反应时间也会有明显的影响。从表7的测定综合结果来看, ABC, 其间主要影响因素是底物浓度、DNS用量和ΔOD值。所以如果某一方法集中采用了偏高的条件, 那将会导致更大的偏差。 ⑵酶活力是用酶所催化的化学反应速度来表示的, 但在实际测定中往往与所用的测定方法、底物特性、催化反应条件和DNS与糖反应条件等因素有关。因此采用不同的测定方法则有不同的结果。目前纤维素酶活力的测定, 仍存在方法和单位表示不统一的问题。为今后统一计, 各方应依据该酶的特性, 综合考虑, 以便将有关因素恒定在最适当的数值范围内, 制定统一的分析方法。这样才有可能将来源不同的同种酶制剂加以比较。