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放线菌链霉菌lh121对南方根结线虫的生物活性 根节点线虫（meloidold.）是植物根系的内生物，是危害农业生产的重要植物病原体。据不完全统计,根结线虫寄主超过2000种,遍及粮食、蔬菜、果树及花卉等作物,造成的年损失达10亿美元。近年来,随着保护地栽培技术的推广,复种指数的增加,根结线虫的危害逐年加重。据江苏省调查,根结线虫使大棚蔬菜常年减产15%～25%,严重时达70%以上。根结线虫寄主范围广,繁殖速度快,且为土壤传播,所以很难防治。目前生产上的主要防治措施是使用化学杀线剂,但大多数品种毒性强,基于对环境及人、畜安全的考虑,国际上已陆续禁止使用这些药剂。链霉菌在自然界广泛存在,其产生的活性物质类型及作用多样,而国内外还鲜有将链霉菌用于根结线虫防治方面的研究。本项研究进行了链霉菌的菌株分离、杀线活性筛选、菌株鉴定等工作,以期得到有潜力应用于生产上防治根结线虫的菌株。 1 材料和方法 1.1 菌落纯化 2001～2002年从江苏省南京、淮阴和上海三地区采集到30份有机质含量丰富的土样,风干后每份称取5g,用无菌水稀释104倍,吸取0.05ml涂布于高氏培养基平板,5d左右挑取单菌落,纯化后转入斜面4℃保存。 1.2 培养基滤液的制备 将保存菌株活化后,将其孢子悬浮液接种于种子培养基(葡萄糖1g,可溶性淀粉10g,牛肉膏3g,蛋白胨5g,CaCO30.5g,酵母粉5g,MgSO4·7H2O 0.05g,Na2HPO40.19g,KH2PO40.182g,H2O 1000ml,pH7.0-7.2),28℃、170r/min条件下振荡培养48h,然后按10%接种量接种于液体培养基(葡萄糖30g,可溶性淀粉55g,NaCl 2g,CaCO33g,MgSO4·7H2O 0.05g,蛋白胨4g,酵母粉5g,黄豆粉5g),28℃、170r/min条件下振荡培养100h,所得培养物经45μm微孔滤膜过滤、5000r/min离心10min即得培养滤液。 1.3 分次注射,测定致病程度 南方根结线虫由南京农业大学植物线虫实验室提供。分别吸取各菌株培养滤液4ml于直径6cm的小平皿中,每皿加入250头左右的根结线虫二龄幼虫,25℃放置。设置无培养菌株的培养基滤液作对照,每处理重复3次。24h后计算校正击倒率。将击倒效果较好的菌株作为初筛菌株。 用无菌土培育苏粉2号番茄幼苗至5～6叶期,用2ml/株初筛菌株的培养滤液进行灌根处理,48h后接种二龄幼虫250头,40d后观察病情严重程度。设置无菌株培养的培养基滤液作对照,每处理重复3次。受害程度分级标准为:Ⅰ级为没有卵块和根结形成;Ⅱ级为根系上有1～2个根结;Ⅲ级为3～30个根结;Ⅳ级为31～100个根结;Ⅴ级为根结数大于100。 1.4 自杀样品的遗传稳定性的测定 将防效好的菌株连续继代培养6代,再如上测定每代菌株培养滤液对根结线虫二龄幼虫的活性,进一步筛选出其中遗传稳定的菌株。 1.5 lh121根结线虫的治疗 1.5.1 线虫击穿实验 将4ml培养滤液吸入6cm直径的小皿中,每皿加入二龄幼虫200头左右,于25℃放置,定时观察线虫的击倒率;被击倒的虫体吸入清水中,24h后观察恢复情况,不能恢复活性的记为死亡。设置清水处理为对照,每处理重复3次。计算校正死亡率并观察虫体可能发生的生理变化。 1.5.2 培养基滤液的制备 挑取大小一致的单卵块,各取25粒分别放置于6cm小皿中,然后加入筛出菌株的培养滤液4ml,设置无培养菌株的培养基滤液做对照(CK),每处理重复3次。定时观察各皿中孵化出的幼虫数,计算孵化抑制率。 1.5.3 培养基滤液处理 分别以3种方式接种根结线虫二龄幼虫250头和灌根2ml筛出菌株的培养滤液:①接种48h后灌根;②接种与灌根同时处理;③灌根48h后再接种。设置无培养物的培养基滤液做对照,每处理重复3次。40d后观察发病严重程度,计算根结指数及卵块形成抑制率。 1.6 分类和识别lh121 1.6.1 菌株悬浮液的制备 用制备好的无机盐淀粉培养基和甘油-天门冬素培养基制备平板,待培养基快要凝固时,以45a 角斜插入无菌盖玻片,使之与培养基密合。将待观察的菌株的悬浮液沿盖玻片与培养基的交接处画线接种,28～30℃培养。定时将盖玻片取出放在载玻片上观察孢子丝的形态,孢子成熟时用透射电子显微镜观察其表面纹饰。 1.6.2 碳源种类对菌株活性的影响 采用葡萄糖天门冬素、高氏一号合成培养基斜面接种,28℃培养。定时观察基内菌丝体、气生菌丝体、孢子丝、孢子和可溶性色素的颜色。将菌株接种于酪氨酸琼脂斜面,观察有无黑色素的产生。配制基础培养基,然后分别加入D-葡萄糖、蔗糖、D-甘露醇、D-果糖、D-木糖、D-半乳糖、L-鼠李糖、L-阿拉伯糖、棉籽糖、I-肌醇等碳源,以无碳源培养作负对照,葡萄