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响应曲面法优化超声波提取蓝莓原花青素的工艺研究 0 超声波辅助提取 黑莓[r.p.l]是蔷薇科的一种悬钩子植物。果实柔软多汁，包括保湿、茶多酚、超氧化物硫化酶（sod）、黄酮等抗衰老、去自由基和其他物质。黑莓果实呈紫黑色,富含花色苷食用色素,该色素天然无毒、色泽鲜艳、稳定性好且具有保健功能,其在食品、药品、化妆品行业有着广阔的应用前景。 超声波辅助提取是一项新型的天然产物辅助溶剂提取技术,它利用超声波的空化作用、热效应、机械作用加速细胞壁的破碎使胞外溶剂容易进入细胞内,从而促进胞内物质的溶出,提取效率高,超声波辅助提取已经在天然色素中的提取有应用,如李大婧等用超声波辅助提取万寿菊中叶黄素的萃取率可达97%以上,李山等用超声波辅助提取花生壳中的黄色素提高了提取效率。但超声波辅助提取黑莓原花青素的研究未见报道,本研究以黑莓为原料,以乙醇为溶剂对黑莓原花青素的超声波辅助提取优化及其在此条件下所得黑莓原花青素抗氧化性进行研究,为黑莓资源的开发利用提供依据。 1 材料和方法 1.1 试剂及树脂 原料:黑莓(百盛品种)果实2005年5月15日采于杨凌,成熟果实为紫黑色,含水率76.6%,于–20℃冻藏。 试剂:原花青素标样(纯度95%),二苯代苦味酰自由基(DPPH),水杨酸,三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)、邻苯三酚、HCl、抗坏血酸(Vc)、茶多酚等均为市售分析纯试剂,HPD-100A型大孔吸附树脂购于河北沧州宝恩化工有限公司。 主要仪器:KQ600DB超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司),UV-1700分光光度计(日本岛津公司),SIM FREEZE DRYER真空冷冻干燥设备(德国西门子公司)等。 1.2 方法 1.2.1 原花青素测定 配制浓度为2.0mg/mL的标准液。分别移取原花青素标准液6、7、8、9、10mL,用无水乙醇定容至10mL,以无水乙醇溶液做空白,利用UV-1700紫外分光光度计测定最大吸收波长处(495nm)的吸光值,绘制原花青素标准溶液的标准曲线。并计算出回归方程:A=0.6529C-0.0042(A——495nm处吸光度,C——原花青素标样浓度),相关系数为0.9995。 1.2.2 原花青素含量测定 称取5.00g的黑莓果实置于圆底烧瓶中,以75%的乙醇作为提取溶剂,超声波辅助提取,抽滤,滤液用75%的乙醇定容至100mL,作为待测液。移取10mL待测液至50mL容量瓶中,在最大吸收波长处测定吸光度A,计算原花青素含量,重复三次,取平均值。原花青素得率按下列计算公式计算: 式中Y——根据回归方程计算得到的原花青素浓度,mg/mL;100,50——稀释倍数;10——待测液体积,mL;W——黑莓果实重,g。 1.2.3 x—响应曲面法试验设计 采用统计分析软件SAS8.1进行4因素3水平的响应面分析试验,以原花青素得率作为响应值。变量编码根据下述方程进行: 式中xi——自变量代码值;Xi——自变量真实值;Xi0——自变量在试验中心点的真实值;△Xi——自变量的变化步长。在预试验的基础上确定因素和水平,自变量X1(提取温度,℃),X2(乙醇溶液料液比),X3(提取时间,min),X4(超声功率,W)4个自变量因素编码及水平见表1。 1.2.4 溶液在dpph溶液下的吸光度测定 用HPD-100A型大孔吸附树脂纯化优化条件下的黑莓原花青素提取液,上柱液的pH值为2.0~3.0,样液体的浓度为0.671mg/mL,吸附流速为1.0mL/min,以60%的乙醇为解吸剂,洗脱流速为0.7mL/min。洗脱液浓缩冷冻干燥,备用(后相同)。75%乙醇配制50μg/mL的黑莓原花青素溶液,分别吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mL于20支具塞试管中(分2组),向其中一组加入DPPH溶液至4mL,摇匀30min后在517nm波长下测吸光度,即为Ai,用75%的乙醇为参比;同时测定2mL DPPH溶液与2mL 75%的乙醇混合后的吸光度,即为Ac;向另一组中加入无水乙醇至4mL,混合后测其吸光度,即为Aj。根据下式计算清除率K: 同时配制浓度为50μg/mL的茶多酚溶液,按照上述步骤计算对DPPH自由基的清除率。 1.2.5 b蓝莓原花青素a 依次加入10mmol/L的水杨酸-无水乙醇溶液0.5mL,随后加入不同体积的50μg/mL的黑莓原花青素溶液,再加入10mmol/L的FeSO40.5mL,3.5mL蒸馏水,混匀后加入88mmol/L的H2O25mL,启动Fenton反应,摇匀后于510 nm波长下测定吸光度,即为A1;取0.5mL的蒸馏水代替浓度为10mmol/L FeSO4,所测得的吸光度即为A2;取0.5mL的蒸馏水代替黑莓原花青素溶液,所测得的吸光