进出口食品中荷叶碱的测定编制说明.docVIP

《保健食品中荷叶碱的含量测定- 高效液相色谱-质谱/质谱法》编制说明 1 任务来源 本标准是按照国家认监委下达的计划编号为“2009B564” 标准任务制定的。按照检验检疫行业标准SN/T 0001-1995 《出口商品中农药、兽药残留量及生物毒素检验方法标准编写的基本规定》（以下简称《基本规定》的要求进行起草，并按GB/T 1.1-2009《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写》的要求进行编制。本标准由湖南出入境检验检疫局承担研究和起草。 2 标准制定的意义 荷叶为睡莲科植物莲（Nelumbo nucifera Gaertn.）的干燥叶，具有清热解暑、升发清阳、散瘀止血的功效[1]。现代临床表明荷叶具有较好的减肥降脂之功效，其主要活性成分为荷叶碱、莲碱、原荷叶碱、前荷叶碱等生物碱[2-3]。1991年，我国已将荷叶列入第2 批“既是食品又是药品”的名单之中，荷叶在食用及药用两方面均有较广泛的应用。近年来，以荷叶为主要成分的降脂减肥食疗制品的应用越来越广泛，现已开发出各种以荷叶为主要成分的减肥茶和降脂胶囊，主要有宁红减肥茶、三花舒压力茶、减肥健身茶、天雁减肥茶、降脂减肥茶、荷叶减肥茶和降脂胶囊等，主要用于减肥及冠心病、高血压病、糖尿病、脑血管疾病的预防。目前关于荷叶化学成分报道较多，主要是薄层色谱法，紫外分光光度法和高效液相色谱法。但以荷叶为原料的保健食品中荷叶碱的分析方法较少报道。因此，建立高效液相色谱(质谱联用法测定荷叶碱的含量对于以荷叶为原料的保健食品的质量、确保其功效有重要意义。 3 标准编制的依据 本标准遵循GB/T1.1-2009 《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写规则》和GB/T20001.4-2001《标准编写规则 第4部分：化学分析方法》的编写规则。 4 标准主要内容的确定 目前，国内外对荷叶的研究较多，而对其生物碱的分析只局限于TLC[4]，紫外分光光度法[5] 和高效液相色谱法[6]。由于液相色谱－质谱的高选择性和高灵敏度，是目前国际公认的先进的检测方法。因此，我们采用液相色谱－质谱联用法对荷叶碱进行了方法研究。 本标准在采用采用液相色谱－质谱联用法对荷叶碱分析时，采用甲醇进行提取，提取液离心，过滤后直接进色谱系统分析。此方法简单、稳定、检测限、回收率和精密度均符合和《残留分析质量控制指南》的要求。, 或严重拖尾。本实验比较了水- 乙腈、0. 1% 的甲酸水溶液-乙腈、0. 1%的氨水溶液- 乙腈、甲醇- 水、 甲醇- 乙酸等流动相组合对荷叶碱进行洗脱。结果发现使用端基封尾的C18色谱柱，0.1％乙酸和乙腈作流动相，梯度洗脱时，能有效的将杂质与分析物分离，基本消除基质效应的影响 时间（min） 0.1％乙酸水溶液（%） 乙腈（%） 0.0 90 10 4.0 60 40 10.0 10 90 12.0 10 90 12.1 90 10 15.0 90 10 4.2 质谱条件的优化 荷叶碱的分子式为C19H21NO2,分子量为295。以流动注射的方式考察了荷叶碱最优的电离条件，在实验部分所述的条件下，得到了标准品质谱图（图1）。m/z 296.4是荷叶碱分子加氢后形成的准分子离子[M+H]+， m/z 265.4为断裂碳氧键形成的碎片离子。 图1荷叶碱标准品的ESI质谱图 扫描类型：多反应检测(MRM)；离子极性：正离子（+）；离子源 ：电喷雾，Turbo Spray；通过以上数据分析，确定MRM参数为： 表1 多反应监测条件 化合物 母离子 (m/z) 子离子 (m/z) 驻留时间（ms） 去簇电压 (DP)/V 碰撞能量(CE)/ V 碰撞室 入口电压 (EP)/V 碰撞室 出口电压(CXP)/V 荷叶碱 296.3 265.3 200 80 24 10 15 250.5 200 80 30 10 15 注：带“*”的离子为定量离子。 4.3 样品提取溶液的选择 荷叶碱在甲醇、氯仿中具有很好的溶解性，但是由于氯仿与流动相不兼容，色谱峰展宽，而用甲醇溶解的样品，可得到对称性好，峰宽较窄的色谱峰，在提取效率一致的情况下，选择甲醇作为萃取溶剂。 4.4 方法的线性范围与测定低限 在标准方法所确定的实验条件下，逐级稀释标准工作液进行测定，以峰面积（Y轴）对相应的荷叶碱的浓度（X轴）作图，结果表明，当荷叶碱的浓度在0.1 ng/mL-100ng/mL范围内时，线性关系良好，回归曲线方程为Y＝1.26e5X+4930，r＝1.000。当样品中的荷叶碱超过此线性范围时，可适当稀释。以信噪比S/ N= 10 时，得最低定量限为0.1 ng/mL( S /N = 10)，经过测定方法的室内实验，确定本方法对荷叶碱的测定低限为0.01mg/kg。 4.5方法回收率和