桑叶水提物对2型糖尿病小鼠花生四烯酸代谢通路的影响.docxVIP

桑叶水提物对2型糖尿病小鼠花生四烯酸代谢通路的影响 据国际糖尿病联合会（International Diabetes Federation，IDF）2019年的报告DM状态下，肉毒碱棕榈酰基转移酶1A（carnitine palmitoyltransferase 1A, CPT1A）、脂肪酸合成酶（fatty acid synthase, Fasn）和磷脂酶A2（phospholipase A2, PLA2）表达水平增加桑叶是桑科植物桑的干燥叶，为药食两用植物，具有疏散风热，清肺润燥，清肝明目的功效。《本草拾遗》中记载：“细锉，大釜中煎取如赤糖，去老风及宿血，降糖”；《本草纲目》中记载“桑叶乃手、足阳明之药，汁煎代茗，能止消渴”。现代药理学研究证实，桑叶水提物、醇提物及其含有的多糖、黄酮类、生物碱、酚酸、纤维素等成分，均具有防治DM的作用因此，本文主要在链脲佐菌素（streptozotocin, STZ）联合高脂高糖（high fat and high sucrose, HFHS）饮食诱导的T2DM小鼠动物实验模型上，观察桑叶水提物（mulberry leaf water extract, MLWE）对T2DM小鼠肝脏中AA生成及代谢的相关酶的表达及血液中AA及其相关PGs、HETEs、EETs类代谢产物水平的影响，探讨MLWE对T2DM的防治作用及潜在机制。材料与方法仪器与试剂 NanoDrop 1000核酸浓度测定仪（美国Thermo公司）；PCR仪（美国AB公司）；酶标仪（Elx808，美国Bio Tek公司）；Light Cycler 480 II 实时荧光定量PCR（quantitative real time PCR，qPCR）仪（瑞士Roche公司）；半干转印系统（170-3940，美国Bio-Rad公司）；Agilent 1260-6460液相色谱三重四级杆串联质谱仪（美国Agilent公司）；Fortis C18色谱柱（1.7 μm, 50 mm × 2.1 mm）（美国Waters公司）；固相萃取C8柱（苏州金郡实验耗材）；真空冷冻浓缩干燥仪（LNG-T98，太仓市科教器材厂）。一抗稀释液、二抗稀释液、BCA（bicinchoninic acid）蛋白浓度测定试剂盒和磷酸酶抑制剂（上海碧云天生物技术研究所）；Fasn、CPT1A、COX-2、LOX-5和CYP4A抗体（英国Abcam公司）；山羊抗兔IgG（美国LI-COR公司）；动物 8周龄雄性C57BL/6J小鼠，约25 g（上海斯莱克实验动物有限责任公司）。动物生产许可证号：SCXK (沪) 2008-0016。饲养于徐州医科大学SPF级实验动物中心，温度（22 ± 2）oC，湿度55% ± 5%，12 h光暗循环，饲料与水消毒后自由摄取。动物实验获得徐州医科大学伦理委员会批准（批准号：XZMULL201612024），实验严格按照国家和徐州医科大学动物中心动物使用管理条例进行。MLWE的制备 取桑叶1 kg，粉碎，加水15 L微沸煮4 h，过滤，滤液真空冷冻干燥，得MLWE干浸膏粉末（1 mg干浸膏约相当于3 g生药）。经本课题组建立的高效液相色谱法（high performance liquid chromatography, HPLC）测定，5批不同操作者在不同时间制备的MLWE在254 nm波长下共检测到共有峰31个，它们之间的相似度均大于0.999，原儿茶酸、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、芦丁和紫云英苷的含量分别为0.56、6.72、11.89、6.76、1.84和0.96 mg·g动物分组、造模、给药及样本收集 C57BL/6J雄性小鼠适应性饲养7天后，称重，测定空腹血糖（fasting blood glucose, FBG）基线水平（0周）后，随机分为正常组和模型组。正常组给予普通饲料，模型组给予HFHS饲料（脂肪占60%，蛋白质占20%，碳水化合物占20%），4周后，各组小鼠均禁食不禁水12 h，模型组小鼠按90 mg·kgAA及其相关代谢产物测定色谱-质谱条件 Fortis C18色谱柱；流动相：水（A）和乙腈（B），A、B中均含有0.1 mmol·L血清样品处理 取小鼠血清，上样于活化后的C8固相萃取小柱，用1 mL 0.1%甲酸冲洗后，再用1 mL甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，冷冻真空干燥，50%乙腈水溶液复溶，20 000 方法学验证 选取23:00~1:00小鼠血清作为空白生物基质配制模拟生物样本及质控样本。参照美国食品药品监督管理局 (Food and Drug Administration, FDA) 和国际人用药品注册技术协调会（International Confer