快速高分辨液相色谱-质谱联用技术在血浆组学研究中的应用.docxVIP

快速高分辨液相色谱-质谱联用技术在血浆组学研究中的应用 1 血浆检测的难点及对策 代谢组学是一项研究生物内源性代谢的一般和变化规律的科学。作为系统生物学的重要组成部分，它在药物、药理学等领域得到了迅速发展，并在药物筛选和其他领域得到了成功应用。人体血浆作为代谢组学研究中的重要体液样本,其中含有2000多种内源性小分子代谢物,与常见的尿液样本相比,前处理过程相对复杂。首先,由于含有大量的蛋白质类成分,因此进行HPLC-MS分析前需要去除蛋白质;其次,由于血浆中所含成分种类繁多、极性跨度很大,既有高极性的氨基酸、葡萄糖、核苷类等,也有低极性的脂类、固醇类等代谢物。代谢物成分的复杂性增加了血浆样品分析的难度与挑战。本研究采用快速高分辨液相色谱-质谱联用技术(Rapid resolution liquid chromatography-mass spectrometry, RRLC-MS)技术,针对血浆样品前处理中常用的有机溶剂沉淀蛋白法与固相萃取方法进行了比较,并进行了方法优化及方法学考察;采用主成分分析(Principal component analysis, PCA)对穿插在检测序列中的质量控制(Quality control, QC)样品数据进行统计分析,最终建立了适合于代谢组学研究的血浆样品前处理方法。 2 实验部分 2.1 仪器、标准品及测量体 Agilent 1200 Series RRLC system(德国Waldbronn Aglient Technologies 公司);QTRAPTM四极杆-线性离子阱串联质谱仪(美国Applied Biosystems/MDS SCIEX公司),配有ESI源和Analyst QS 1.5数据处理系统; 乙腈、甲醇、乙醇、丙酮和甲酸(色谱纯, Merck公司);标准品分别购自Fluka公司、Sigma-Aldrich公司及中国药品生物制品检定所;实验用水为超纯水。 人血浆样品(EDTA抗凝),采自中国医学科学院北京协和医院,采集后立即于-80 ℃冷冻保存。 2.2 流动相和线性梯度洗脱条件 Zorbax Aq-C18色谱柱 (100 mm×2.1 mm×1.8 μm; 美国Agilent公司) ;流动相:A为H2O(含0.1% formic acid); B为CH3CN。线性梯度洗脱:0～20 min,0～100% B;20～23 min,100% B。每次进样前,色谱柱在初始流动相条件下平衡8 min,流速 250 μL/min。柱温 60 ℃;进样量 5 μL。 2.3 dp气大设 ESI离子源,分别采用正、负离子EMS扫描模式,喷雾电压为5500～4500 V,解簇电压(DP)为50～-50 V,源温度375 ℃,雾化气为7.5 MPa,干燥气为 6.5 MPa,气帘气为4.0 MPa,扫描范围为65～850 Da。数据采集和处理采用Analyst 1.5数据处理系统。 2.4 标准物质和样品的制备 2.5 x-ms-msx-ms 由RRLC-ESI-MS检测获得的QC样品最初数据经过Wiff to mzData translator software (version 1.0.0.4, Applied Biosystems/MDS Sciex) 转换成XCMS可识别的mzData格式,阈值设置为 1%。采用XCMS进行保留时间校准、峰识别、滤噪、峰匹配,获得可视化的原始二维数据阵。获得的数据矩阵导入多变量统计软件SIMCA-P software 12.0 (Umetrics AB, Ume?, Sweden)进行PCA分析。 3 结果与讨论 3.1 提取方法的优化 本研究对血浆处理中常用的有机溶剂沉淀法(包括4种不同的溶剂系统:甲醇、乙腈、甲醇-乙醇(1∶1,V/V);甲醇-乙腈-丙酮(1∶1∶1,V/V)和固相萃取方法进行了系统分析。空白血浆中加入5 μL混合标准品1,采用不同方法进行前处理,通过对各处理方法获得的总离子流图中色谱峰数量、峰强度及混合标准品1中各化合物峰面积的考察,获得每种方法对各成分的提取效果,结果如图1所示。从图1可见,16个化合物经过沉淀蛋白处理后均可得到检测,而经过SPE处理后有3个化合物(烟酸, 肌酐和半胱氨酸)未被检测到。此外,对不同方法处理后的色谱峰强度进行比较发现,大部分化合物在经乙腈沉淀处理后获得的强度最高,而SPE处理后化合物的提取效果较差,这是由于SPE处理时极性大的化合物在固相萃取柱上的保留效果较差, 以致流失;虽然蛋白与小分子的亲和作用,使得在有机溶剂沉淀蛋白时一部分小分子化合物也会随着蛋白一起沉淀而损失,但是与SPE中化合物的流失相比,大部分化合物,尤其是极性较大化合物的提取效果更好,因此,目前诸多研究中血浆前处理也采用乙